Anar al contingut

Cas9

De L'Enciclopèdia, la wikipedia en valencià
Cas9

Cas9 (CRISPR associated protein 9) és una enzima endonucleasa d'ADN dirigida per un ARN guia que es troba associada en el sistema CRISPR (Repeticions Palindrómicas Curtes Agrupades i Regularment Interespaciadas). Este es tracta d'un sistema d'immunitat que pot trobar-se en numeroses bactèrias, com el Streptococcus pyogenes. Cas9 és capaç de memorisar seqüències de ADN de bacteriòfecs invasores o de plásmidos que ataquen a la bactèria per a, més tart, reconéixer este ADN, i actuar sobre ell, inactivándolo.[1][2] Cas9 realisa este procés desenrollando el ADN exógeno (actuant com ho faria una helicasa) i comprovant si és complementari a alguna regió espaciadora de CRISPR. Si el substrat de ADN és reconegut, Cas9 s'adherix a el ADN invasor i ho talla en una determinada regió de manera que queda inactivado. En este sentit, el sistema CRISPR-Cas9 és un mecanisme molt similar al mecanisme d'interferència de ARN (ARNi) d'eucariota.


La proteïna Cas9 s'ha utilisat en gran medida com una ferramenta d'ingenieria genómica per a induir el trencament dirigit de el ADN de doble cadena. Estes ruptures poden conduir a la inactivación gènica o a l'introducció de gens heterólogos a través d'unió no homòloga i recombinació homòloga respectivament en molts organismes de model de laboratori. Junt en les nucleasas de zinc i les proteïnes TALEN, Cas9 s'està convertint en una ferramenta destacada en el camp de l'edició del genoma. Cas9 ha guanyat la tracció en els últims anys, ya que pot escindir casi qualsevol seqüència complementària a la guia RNA.[2] Degut a que la especificitat de destí de Cas9 prové de l'ARN guia: la complementarietat de ADN i no modificacions de la pròpia proteïna (com TALENs i dits de zinc), l'ingenieria Cas9 per a dirigir el nou ADN és senzill[3][4] Les versions de Cas9 que s'unixen, pero no escindixen el ADN cognado pot ser utilisat per a localisar transcripcional activador o repressors a seqüències de ADN específic en la finalitat de controlar l'activació transcripcional i la repressió[5][6] L'orientació de Cas9 s'ha simplificat per mig de l'ingenieria d'un sol ARN guia quimérico. Els científics han sugerit que els impulsos genètics basats en Cas9 poden ser capaços d'editar els genomes de poblacions sanceres d'organismes.[7] En 2015, els científics varen utilisar Cas9 per a modificar el genoma d'embrions humans per primera volta.[8]

Estudis estructurals de Cas9

[editar | editar còdic]

Visió de conjunt

[editar | editar còdic]
Estructura cristalina de Cas9 en forma de Apo, resolta per M. Jinek et al en el seu paper de Science del 2014, l'interpretació es va portar a terme utilisant el software Chimera de UCSF.
Archiu:Cas9 Anders CAPS 70 bound structure.png
Estructura cristalina de Cas9 lligada a el ADN, resolta per Anders et al en el seu paper de Naturedel 2014. l'interpretació es va portar a terme utilisant el software Chimera de UCSF.
Archiu:Cas9 5 CAPS 73 .png
Estructura cristalina de la proteïna associada a CRISPR Cas9, basada en PDB 5AXW per Nishimasu et al.

L'estructura cristalina de Cas9 es va unir a el ADN, segons lo resolt per Anders et a l'en el seu paper de la naturalea 2014. Les interpretacions estructurals es varen realisar utilisant el software Quimera de UCSF.

Cas9 presenta una arquitectura bi-lobulada en el ARN guia situat entre el lòbul alfa-helicoidal (blava) i el lòbul de la nucleasa (cian, taronja i grisa). Estos dos lòbuls estan conectats a través d'una sola hèliç de pont. Existixen dos dominis de nucleasa situats en el lòbul de nucleasa multidominio, el RuvC (gris) que escindix la cadena de ADN no diana i el domini de nucleasa HNH (cian) que escindix la cadena diana de ADN. De manera interessant, el domini RuvC està codificat per llocs secuencialmente dispars que interactuen en l'estructura terciaria per a formar el domini d'escissió RuvC.

Una característica clau de el ADN diana és que deu contindre un motiu adjacent protospacer (PAM) que consistix en la seqüència de tres nucleòtits-NGG. Este PAM és reconegut pel domini d'interacció PAM (domini PI, taronja) situat prop de l'extrem C-terminal de Cas9. Cas9 experimenta canvis conformacionales distints entre els Estats Units de apo, de ARN de guia i de ARN de guia: enllaçats de ADN, que es detallen a continuació. PAM és reconegut per Arg 1333 i Arg 1335 en el recalat principal per una β-forqueta, a on s'unixen a dG2 i dG3 de PAM.[9]

Estructures de cristal en detalle

[editar | editar còdic]

Cas9 reconeix l'arquitectura de talle-bucle inherent en el locus CRISPR, que media la maduració de el CRRNA-tracrRNA ribonucleoprotein complex.[10] Cas9 en complex en CRISPR ARN (CRRNA) i trans-activació crRNA (tracrRNA), ademés, reconeix i degrada la dsDNA objectiu.[11] En l'estructura de co-cristal que es mostra ací, el complex de CRRNA-tracrRNA es reemplaça per un ARN de guia única quimérico (sgRNA, en roig) que s'ha demostrat que té la mateixa funció que el complex de ARN natural.[12] La base de sgRNA emparellat en ssDNA objectiu està ancorat per Cas9 com una arquitectura en forma de T. Esta estructura cristalina de l'enzima Cas9 unida a ADN revela canvis conformacionales distints en el lòbul alfa-helicoidal sobre el lòbul de nucleasa, aixina com la localisació en el domini HNH. La proteïna consistix en un lòbul de reconeiximent (REC) i un lòbul de nucleasa (NUC). Deu observar-se que totes les regions llevat el HNH formen estretes interaccions entre sí i el complex sgRNA-ssDNA, mentres que el domini HNH forma pocs contactes en el restant de la proteïna. En una atra conformació del complex Cas9 observada en el cristal, el domini HNH no és visible. Estes estructures sugerixen la flexibilitat conformacional del domini HNH.

S'han publicat vàries estructures de cristal, incloent:

  • Jinek et al. Les estructures de les endonucleasas Cas9 revelen l'activació conformacional mediada per ARN. Science, Feb 2014[13]
  • Anders et al. Bases estructurals del reconeiximent de ADN diana depenent de PAM per la endonucleasa Cas9. Nature Sept 2014.[14]
  • Nishimasu et al. Estructura cristalina de Cas9 en complex en ARN guia i ADN objectiu. Cell Feb 2014[15]
  • Jiang et al. Un complex de ARN de guia Cas9 preorganizado per al reconeiximent de ADN diana. Ciència, juny de 2015[16]
  • Jiang et al. Estructures d'un complex CRISPR-Cas9 R-loop acebat per a l'escissió de el ADN. Ciència, Feb 2016[17]

Interaccions entre sgRNA i Cas9

[editar | editar còdic]

En el complex sgRNA-Cas9, basat en l'estructura cristalina, els dominis REC1, BH i PI tenen contactes importants en la columna vertebral o les bases en la regió de repetició i espaciadora.[18][14] S'han provat varis mutantes Cas9 que inclouen deleción de dominis REC1 o REC2 i mutacions de residus en BH. Els mutantes relacionats en REC1 i BH mostren una activitat menor o cap en comparació al tipo salvage, lo que indica que estos dos dominis són crucials per al reconeiximent de sgRNA en la seqüència repetida i l'estabilisació de tot el complex. Encara que les interaccions entre la seqüència espaciadora i Cas9, aixina com el domini PI i regió de repetició necessiten estudis adicionals, el co-cristal demostra clar interfaç entre Cas9 i sgRNA. De fet, l'estructura cristalina recent de Cas9 unit a ARN de guia única revela que la seqüència de "llavor" de ARN de 10 nucleòtits es preordena en una conformació de forma A para el reconeiximent de ADN diana. Ademés de les seqüències de llavors preordenadas, la comparació del complex Cas9-sgRNA en l'estructura unida a el ADN diana (PDB 4UN3) revela que els llocs que interaccionen en PAM (R1333 i R1335) responsables de la 5'-NGG-3 'PAM Reconeiximent es coloquen prèviament abans d'unir-se a el ADN diana. En conjunt, estes observacions estructurals mostren que la regió espaciadora del sgRNA, especialment la regió de la llavor, és essencial per a desencadenar Cas9 per a formar una estructura de reconeiximent de ADN competent que està llest per a acoplar seqüències diana de ADN de doble bri.[16]

Digestió de l'objectiu

[editar | editar còdic]

L'anàlisis de seqüències anteriors i els estudis bioquímics han sugerit que Cas9 conté dominis homòlecs de endonucleasa RNasa H i HNH que són responsables d'escissions de dos bri de ADN diana, respectivament. Estos resultats són finalment provats en l'estructura. Encara que la baixa similitut de seqüències, la seqüència similar a RNasa H té un plec RuvC (un membre de la família RNasa H) i la regió HNH es plega com T4 Endo VII (un membre de la família de endonucleasas HNH). Els treballs anteriors sobre Cas9 han demostrat que el domini HNH és responsable de l'escissió de la seqüència complementària de el ADN diana i RuvC és responsable de la seqüència no complementària (Westra, et al., 2012; Wiedenheft, et al., 2014).

Llectura adicional

[editar | editar còdic]
  • (2015).Virology.479-480
213–20.doi:10.1016/j.virol.2015.02.024."Bacterial CRISPR/Cas ADN endonucleases: Una tecnologia revolucionària que dramàticament podria impactar viral busca i tractament". Virología. 479-480: 213–20. doi:10.1016/j.virol.2015.02.024. PMID 25759096.
  • Ian M. Slaymaker; Linyi Gao; Bernd Zetsche; David Un. Scott; Winston X. Yan; Feng Zhang (2015). (2015).Science.
Published online.doi:10.1126/science.aad5227.Ciència: Publicat en llínea. doi:10.1126/ciència.aad5227.
  • CRISPR-Cas: Un Manual de Laboratori Editat per Jennifer Doudna, Universitat de Califòrnia, Berkeley; Prashant Mali, Universitat de Califòrnia, Sant Diego
  • : Novell CRISPR/Cas9 Monoclonal Anticòs Diagenode llança l'indústria primer monoclonal l'anticòs que apunta CRISPR/Cas9


Referències

[editar | editar còdic]
  1. ↑ Nature.519(7542)
    199–202.doi:10.1038/nature14245.
  2. ↑ 2,0 2,1 Science.337(6096)
    816–21.doi:10.1126/science.1225829.
  3. ↑ Science.339(6121)
    819–823.doi:10.1126/science.1231143.
  4. ↑ Nature Methods.10(10)
    957–63.doi:10.1038/nmeth.2649.
  5. ↑ Nature Biotechnology.31(9)
    833–8.doi:10.1038/nbt.2675.
  6. ↑ Cell.154(2)
    442–51.doi:10.1016/j.cell.2013.06.044.
  7. ↑ eLife.3
    i03401.doi:10.7554/eLife.03401.
  8. ↑ Nature.doi:10.1038/nature.2015.17378.
  9. ↑ Nature.513(7519)
    569–573.doi:10.1038/nature13579.
  10. ↑ Nature.482(7385)
    331–8.doi:10.1038/nature10886.
  11. ↑ (2013).Nat Protoc.8(11)
    2281–308.doi:10.1038/nprot.2013.143.
  12. ↑ (2012).Science.337(6096)
    816–21.doi:10.1126/science.1225829.
  13. ↑ Science.343(6176)
    1247997.doi:10.1126/science.1247997.
  14. ↑ 14,0 14,1 Nature.513(7519)
    569–73.doi:10.1038/nature13579.
  15. ↑ Cell.156(5)
    935–49.doi:10.1016/j.cell.2014.02.001.
  16. ↑ 16,0 16,1 Science.348(6242)
    1477–81.doi:10.1126/science.aab1452.
  17. ↑ Science.351(6275)
    867–71.doi:10.1126/science.aad8282.
  18. ↑ Cell.156(5)
    935–49.doi:10.1016/j.cell.2014.02.001.
Obtingut de «https://www.lenciclopedia.org/w/index.php?title=Cas9&oldid=716732»