Citometría de fluix

Anàlisis d'una mostra d'aigua marina contenint picoplancton fotosintético per mig de citometría de fluix mostrant tres poblacions diferents (Prochlorococcus, Synechococcus, i picoeucariotas)

La citometría de fluix és una tecnologia biofísica basada en l'utilisació de llum làser, empleada en el reconte i classificació de cèlules segons les seues característiques morfològiques, presència de biomarcadorés, i en l'ingenieria de proteïnes. En els citómetros de fluix, les cèlules suspeses en un decorregut travessen un finíssim tubo transparent sobre el que incidix un prim raig de llum làser, la llum transmesa i dispersada pel passage de les cèlules a través del tubo s'arreplega per mig d'uns dispositius de detecció, permetent fer inferència sobre tamany i complexitat de les cèlules. També permet l'anàlisis multiparamétrico simultàneu d'atres característiques físiques i químiques, evaluant en promig més de dos mil partícules per segon.

La citometría de fluix és una tècnica utilisada en forma rutinària en molts centres de salut per al diagnòstic i seguiment de moltes malalties tals com les leucèmias, granulomatosis crònica, i sida; no obstant té moltíssimes atres aplicacions en investigació bàsica, pràctica i ensajos clínics. Una variant comuna d'esta tècnica és la separació física de partícules segons les seues propietats, amprant-se per eixemple per a purificar poblacions d'interés.

Història

El primer citómetro de fluix basat en la medició d'impedència, és dir utilisant el principi Coulter, va ser descrit en la palesa d'Estats Units N.º 2.656.508, expedida en 1953 a nom de Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler va ser l'inventor del precursor dels citómetros de fluix actuals, en particular del tipo separador de cèlules. El primer dispositiu de citometría de fluix basat en fluorescència (ICP 11) va ser desenrollat en 1968 per Wolfgang Göhde de l'Universitat de Münster, i declarat en la palesa d'Alemània N.º 1815352 el 18 de decembre de 1968. I comercialisat per primera volta en els anys 1968 i 1969 per l'empresa alemana Partec encarregada del desenroll i producció a través de Phywe AG en Gotinga. En aquell temps els métodos d'absorció electromagnètica tenien el favor de la comunitat científica sobre els métodos fluorescents. Poc temps despuix va començar el desenroll comercial dels citómetros de fluix, incloent el citofluorógrafo (1971) de l'empresa Bio/Physics Systems Inc. (més tarde Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de l'empresa Partec, i el primer dispositiu FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe i el Epics de la Coulter Corporation en 1977/78.

Orige del nom de la tècnica

El nom original de la citometría de fluix era "citofotometría de pols" (en Alemà: Impulszytophotometrie), que va anar el nom publicat en la primera palesa d'aplicació pràctica de la citometría de fluix fluorescent. Recent en la 5.ª Conferència sobre Citometría Automatizado de l'American Engineering Foundation realisada en Pensacola, Florida en 1976 -huit anys despuix de la presentació del primer citómetro de fluix fluorescent (1968)- es va acordar utilisar el nom de citometría de fluix, un terme que ràpidament va guanyar popularitat.

Principi

Esquema de disposició d'elements en un citómetro de fluix. Una font emissora de llum monocromàtica, usualment un fes de llum làser (A) envia un raig que és colimado (L1) i enfocat (L2) per mig de lents sobre la cambra de fluix laminar (C), després de travessar la cambra el raig de llum directa és detingut per una pantalla (s), mentres que la llum dispersada és enfocada per una atra lent (L3) sobre un fotodiodo (D1), açò constituïx el detector de dispersió frontal (FSC). La llum dispersada lateralment i la fluorescència s'enfoquen per mig d'una lent sobre un espill dicroico (M) que reflectix la major part de la llum d'igual llongitut d'ona a la produïda per la font (A), travessa un filtre (F1) i incidix sobre un detector. Açò constituïx el sistema de detecció de dispersió lateral (SSC).La llum que no és reflectida per l'espill dicroico, ya que té una llongitut d'ona diferent a l'emesa, ho travessa i incidix sobre un filtre interferencial (F2) que pot ser ajustat per a una determinada llongitut d'ona, discriminant aixina entre diferents fluoróforos, per a finalment incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), açò constituïx el detector lateral de fluorescència (SFL).

Un raig de llum monocromàtic, usualment de llum làser, és dirigit cap a una finíssima chorrada de líquit hidrodinámicamente enfocat. Es coloca una série de detectors en el punt en el que la chorrada de líquit travessa el raig de llum. Un es coloca en llínea en el raig de llum (a este detector li'l coneix com FSC, per Forward Scatter o detector de Dispersió Frontal), i varis angularment a la trayectòria del raig (a estos li'ls coneix com SSC, per Side Scatter, o detectors de Dispersió Lateral); ademés d'un o més detectors de fluorescència. Cada una de les partícules suspeses en un tamany d'entre 0,15 a 0,20 micrómetros que travessen el raig de llum ho dispersen, i les substàncies químiques fluorescents que es troben dins o adherides a la partícules són excitades fins a emetre llum a una llongitut d'ona major que la de la font de llum. Esta combinació de llum dispersada i fluorescència és arreplegada pels detectors, i per mig d'un anàlisis en la fluctuació de l'intensitat lluminosa recollida per cada detector, és possible derivar varis tipos d'informació sobre l'estructura física i química de cada partícula individual.

El detector frontal o FSC brinda informació sobre el volum de la partícula, mentres que els detectors laterals o SSC brinden informació sobre la complexitat interna de la mateixa (per eixemple la forma del núcleu celular, la cantitat i tipo de grànuls citoplasmàtics o la rugosidad de la membrana plasmática). Açò es deu a que els components interns de les cèlules dispersen la llum. Alguns dels citómetros de fluix presents en el mercat han eliminat la necessitat d'un detector de fluorescència i utilisen solament l'informació de llum dispersada per a les medicions. Atres citómetros de fluix són capaços de generar gràfics de les senyes obtingudes de la fluorescència de les cèlules, llum dispersada i llum transmesa.

Archiu:Caps block 22 -toestel. caps block 23

Aspecte del front d'un citómetro de fluix - en este cas es tracta del Fluorescence activated cell sorter (FACSCalibur) de Becton-Dickinson