Patch clamp

Tècnica de fixació en pegat de membrana (en anglés patch clamp)

En electrofisiología la fixació de membranes és una tècnica de laboratori que permet l'estudi individual o múltiple de canals iònics. Esta tècnica pot ser aplicada en una àmplia varietat de cèlules, pero és especialment útil en l'estudi de cèlules excitables com les neuronas, cardiomiocitos, fibres musculars i cèlules beta. També pot ser aplicada a l'estudi dels canals iònics en les bactèries principalment en esferoplastos jagantes preparats. La fixació de membranes és una millora de l'abrazadera de voltage, desenrollada per Erwin Neher i Bert Sakmann a finals dels 70 i començos dels 80. Este descobriment va registrar les corrents d'un canal iònic per primera volta, demostrant la seua participació en processos fonamentals de la cèlula com la generació i conducció del potencial d'acció. Neher i Sakmann varen rebre el Premi Nobel en Fisiologia o Medicina en 1991 gràcies a este treball.

Tècnica bàsica

La gravació en la fixació de membrana usa una micropipeta com electrodo que té una punta oberta de prop de 1 micrómetro (μm) de diàmetro, un tamany que tanca un àrea superficial que a sovint conté un o pocs canals iònics moleculars. Este tipo d'electrodo és diferent del Sharp microelectrode utilisat per a implantar cèlules en registres intracelulars tradicionals a on és sagellat en la superfície de la membrana celular, en lloc d'insertar-les. En alguns experiments la punta de la micropipeta és calfada en una micro forja per a produir una superfície suau que ajuda a formar un sagell d'alta resistència en la membrana. L'interior de la pipeta és omplit en la solució corresponent a la composició iònica de la solució de bany, com en el cas de la gravació conectada per cèlules o el citoplasma de totes les cèlules. Un aram de clorur d'argent és posat en contacte en esta solució i conduïx la corrent elèctrica a l'amplificador. L'investigador pot canviar la composició de la solució o adicionar medicines per a estudiar els canals iònics baix diferents condicions. La micropipeta pressiona una atra volta la membrana celular per a ajudar a la formació d'un sagell d'alta resistència entre el vidre i la membrana (un gigasello ya que la resistència elèctrica és major a la d'un sagell gigaohm). La gran resistència d'este sagell fa possible aïllar eléctricamente les corrents moderades a través de la fixació de membrana en l'incursió de poc soroll, d'esta forma brinda una estabilitat mecànica a la gravació. A diferència de la gravació tradicional de la abrazadera de voltage en dos electrodos, la fixació de membranes usa un sol electrodo per a registrar corrents. Molts amplificadors de la fixació de membranes no utilisen un verdader circuit de abrazadera de voltage sino amplificadors diferencials que utilisen un electrodo per a establir el nivell zero de corrent. Açò permet a l'investigador mantindre un voltage constant mentres s'observa canvis en la corrent. Alternativament pot ser subjectada completament mantenint l'energia constant mentres s'observen canvis en el voltage de la membrana.

Un esferoplasto arreglat en una pipeta de cristal

Variacions

Algunes variacions poden ser aplicades depenent de lo que l'investigador vullga estudiar, les tècniques “inside-out” i “ outside-out” es diuen tècniques de membrana escindida, ya que permeten el registre de l'activitat elèctrica de canals iònics presents solament en una porció de membrana (i no en tota la superfície de la cèlula). Les tècniques d'agrupació de cèlules i membrana extirpada són usades per a estudiar el comportament de canals iònics individuals en la secció de la membrana unida a l'electrodo.

El “whole-cell patch” i el pegat perforat permet a l'investigador estudiar el comportament elèctric de tota la cèlula, en lloc de corrents en un sol canal. El “whole-cell patch” permet accés a l'interior de la cèlula per mig d'una resistència elèctrica baixa, actualment esta tècnica ha substituït en gran mida tècniques de gravació en electrodos d'alta resistència per a registrar corrents a través de tota la membrana celular. Tècnica d'agrupació de cèlules En esta tècnica l'electrodo és sagellat a un tros de membrana i la cèlula permaneix intacta. Açò permet la gravació de les corrents a través d'un sol canal iònic en eixa part específica de la membrana, sense pertorbar l'interior de la cèlula. Per als canals que estan modulats per receptors metatrópicos, el neurotransmissor o droga en estudi és usualment inclós dins de la solució en la pipeta, a on pot fer contacte en lo que havia segut la superfície externa de la membrana. Mentres l'activitat resultant del canal pot atribuir-se a la droga usada, usualment no és possible canviar la concentració de la droga. Aixina la tècnica es llimita a un punt en la curva de resposta de dosis per cada part. Habitualment la reacció de la dosis es porta a terme usant vàries cèlules i membranes. De totes formes el “voltage-gated ion channels” pot ser subjectats en diferents potencials de membrana usant la mateix lloc, lo que causa l'activació del canal i completa la curva I – v (corrent-voltage) pot ser estabilisada en una sola fixació de membrana.