Cebador

Un cebador, iniciador o primer és una cadena d'àcit nucleico o d'una molècula relacionada que servix com a punt de partida per a la replicació del ADN. És una seqüència curta d'àcit nucleico que conté un grup 3'hidroxilo lliure que forma parells de bases complementaris a una bri mòle i que actua com a punt d'inici per a l'adició de nucleòtits en la finalitat de copiar el bri mòle.^{cita requerida}

Es necessita un cebador perque la majoria de les ADN polimerasas, enzimas que catalizan la replicació de el ADN, no poden escomençar a sintetisar una nova cadena de ADN del no res, sino que solament poden afegir nucléotidos a un bri preexistente. Es necessiten dos per a la reacció de PCR, un en l'extrem 3' i l'atre complementari per a l'atre bri. Són d'aproximadament 20 nucleòtits, perque és la cantitat necessària per a que aumente la provabilitat de que s'una a un lloc específic de la cadena de ADN.^{cita requerida}

En la majoria de replicació del ADN, el principal cebador per a la síntesis de ADN és una cadena curta d'ARN. Este ARN ho produïx una ARN polimerasa (primasa); després, una ADN polimerasa ho elimina i ho substituïx per ADN.^{cita requerida}

Moltes tècniques de laboratori en biologia molecular que utilisen ADN polimerasa necessiten cebadores; tècniques com la seqüenciació de ADN i la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Els cebadores usats per a estes tècniques usualment són molècules de ADN curtes i sintetisades de forma química, d'aproximadament vint bases de llongitut. La construcció d'estos cebadores escomença en nucleòsits de 3'-hidroxilo (fosforamidita) adherits a un material cridat vidre de poros controlats (CPG, per les seues sigles en anglés). El 5'-hidroxilo dels nucleòsits és dimetoxitritilo (DMT) cobert, lo que prevé la construcció d'una cadena de nucleòtits. Per a afegir un nucleòtit es remou químicament el DMT i s'afig el nucleòtit. El 5'-hidroxilo del nou nucleòtit queda bloquejat per el DMT, lo que evita l'adició de més d'un nucleòtit a cada cadena. Despuix d'això es repetix el cicle per a cada nucleòtit en el cebador. Esta és una descripció simplificada - el procés en realitat és prou complicat. Per esta raó, la majoria de laboratoris no construïxen els cebadores sino que els compren a empreses especialisades.^{cita requerida}

La seqüenciació de ADN s'usa per a determinar els nucleòtits en una cadena de ADN. Un método de seqüenciació cridat seqüenciació didesoxi, conegut també com método de terminació de cadenes o método Sanger, usa un cebador com a marcador d'inici per a la reacció en cadena.^{cita requerida}

En la reacció en cadena de la polimerasa s'usen cebadores per a determinar el fragment de ADN que s'amplificarà en el procés. La llongitut dels cebadores no sol ser major de 50 nucleòtits (la llongitut es medix en parells de bases, ya que el ADN usualment és de doble filament). La llongitut de el ADN d'un sol filament es medix en bases o nucleòtits, i són iguals a l'inici i al final del fragment de ADN que va a ser amplificat. S'adherixen al bri mòle de ADN en estos punts d'inici i fi als quals s'unix l'ADN polimerasa, i escomença la síntesis de la nova cadena.^{cita requerida}

Archiu:Caps block 32 replication es.svg

La replicació d'ADN o síntesis de ADN és el procés de copiat d'una doble cadena de molècula de el ADN.

Archiu:Caps block 36 primer.png

Replicació d'ADN i cebadores d'ARN. En l'àngul inferior esquerre, es pot observar la lligam del grup hidroxilo.

Descripció

Es tracta de seqüències sintètiques d'oligonucleótidos que s'usen per a reconéixer per apareament complementari seqüències blanc en ADN de plantilla (en anglés, DNA template), que consistix generalment en ADN genómico. Generalment, s'usa un parell de cebadores en PCR per a definir els extrems del producte que va a amplificar-se, i a partir d'ells la ADN polimerasa utilisada inicia la polimeración en direcció 5'-3'. També s'utilisen en reaccions de seqüenciació de ADN, a on s'usa solament un cebador sobre una concentració relativament alta de ADN blanc, per a polimerizar cadenes senzilles de diferents tamanys truncades per dideoxinucleótidos (método de seqüència de Sanger) i aixina determinar les seqüències de bases nitrogenades.^{cita requerida}

Per eixemple, si es té la següent seqüència de ADN de cadena doble a partir de la qual es pretén amplificar per PCR un fragment els llímits del qual estan indicats pel símbol de major o menor, els primers a utilisar podrien ser com els següents:

Cebador revers (en anglés, reverse primer), que sintetisarà la cadena complementària:

3’-tcctgcgatctagct<-5’

...5'-aggaggcgagatgtcgagtcggatcgaccagagcgacccacacaggaccaggacgctagatcga-3'...

...3'-tcctccgctctacagctcagcctagcaggtctcgctgggtgtgtcctggtcctgcgatctagct-5'...

5’->gaggcgagatgtcgga-3’

Cebador cap a avant (en anglés, forward primer)

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ <-Seqüència amplificada

Note's la direccionalidad del oligo, que correspon a la situació química del sucre i el grup fosfat en la base nitrogenada final i inicial. La ADN polimerasa incorpora nucleòtits en direcció 5'-3'. Més detalls, en l'artícul PCR. Est és un eixemple per a mostrar el fonament del funcionament dels cebadores; com a tal, no s'han considerat aspectes del disseny del cebador tals com la termodinàmica del apareamiento, la especificidad de l'amplificament o l'interferència de reaccions d'interacció entre primers o intramoleculares (estructures com a bucles interns en la mateixa cadena).^{cita requerida}

Per a calcular les seqüències òptimes dels cebadores considerant els aspectes mencionats anteriorment, solen utilisar-se algoritmes que calculen dits factors conjuntament i deduir la seqüència que provablement apareará més eficientemente en el ADN blanc.^{cita requerida}

Disseny de cebadores

L'elecció de la llongitut dels cebadores i de la temperatura a la que es conjuguen(T_m) depén de vàries variables a considerar. La temperatura de conjugació d'un cebador es definix com la temperatura a la qual el 50 per cent d'eixa mateixa espècie de molècula de ADN forma una doble hèliç estable i l'atre 50 per cent se separa en molècules d'un sol filament. La temperatura de derretimiento requerida aumenta en la llongitut del cebador. Els cebadores que són massa curts s'anexarien en diverses posicions en una llarga plantilla de ADN, lo que duria a còpies no específiques. Per un atre costat, la llongitut del cebador està llimitada per la temperatura requerida per a derretirlo. Les temperatures de derretimiento molt altes, és dir per damunt dels 80 °C poden causar problemes perque la ADN polimerasa és menys activa en eixes temperatures. La llongitut òptima d'un cebador generalment està entre 20 i 30 nucleòtits en una temperatura de derretimiento d'entre 55 i 65 °C. Hi ha moltes formes de calcular la temperatura de derretimiento dels cebadores (A, G, C i T són el número de nucleòtits en el cebador, respectivament. [Na⁺] és la concentració de Na⁺ en el tubo de PCR).

Método "GC"

Ràpit i senzill per a cebadores en més de 13 nucleòtits.
$T_{\mathrm{m}}=64+41\cdot \frac{G+C-16.4}{A+G+C+T}$

Método "ajustat a la sal"

Més precís que el GC, per a cebadores en més de 13 nucleòtits.
$T_{\mathrm{m}}=100.5+41\cdot \frac{C+G}{A+C+G+T}-\frac{820}{A+C+G+T}\cdot 16.6\cdot {\log }_{10}([{\mathrm{N}\mathrm{a}}^{+}])$

Càlcul de pila de bases

El més precís, pero complicat

$T_{\mathrm{m}}=\frac{\Delta H\frac{\mathrm{c}\mathrm{a}\mathrm{l}}{\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}}}{\Delta S+R\ln (\frac{\text{cebador}}{2})}-273.15{}^{\circ }\mathrm{C}$

a on

$\Delta H$ és l'entalpia de les interaccions de piles de bases ajustades segons factors d'iniciació d'hèliç.

$\Delta S$ és l'entropía de les interaccions de piles de bases ajustades segons factors d'iniciació d'hèliç i segons les contribucions de les sals a la entropía.

$R$ és la constant universal dels gasos $\left(\frac{1.987\text{ cal}}{\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}{\cdot }^{\circ }\mathrm{C}}\right)$

El paquet de software lliure primou pot calcular la temperatura d'anexió d'acort en el método de apilamiento de bases.

Un cebador no deuria anexar-se fàcilment a sí mateix o uns atres del seu tipo, en lo que es produirien bucles o pinces. Açò podria entorpir l'anexió en la plantilla de ADN. No obstant, normalment les pinces són inevitables.

Algunes voltes s'usen cebadores degenerados. Estos en realitat són mescles de cebadores similars pero no idèntics. Poden ser convenients si es va a amplificar el mateix gen d'organismes, ya que els gens mateixos poden ser similars pero no idèntics. L'atre us per als cebadores degenerados és quan el disseny de cebadores es basa en la seqüència de proteïnas. Com a molts codones diferents poden codificar un aminoàcit sol ser difícil deduir qué codón s'usa en un cas particular. Per això la seqüència de cebadores que correspon a l'aminoàcit isoleucina podria ser "ATH", per A d'adenina, T de timina i H d'adenina, timina o citosina, segons el còdic genètic de cada codón. L'us de cebadores degenerados pot reduir àmpliament la especificidad de l'amplificament per PCR. El problema pot resoldre's usant PCR touchdown.