Cromatografía líquida

Separació cromatogràfica

Seqüència d'una separació cromatogràfica en columna en elución per gravetat.

La cromatografía líquida, també coneguda com a cromatografía de líquits, és un método físic-químic de separació de substàncies químiques presents en mescles més o menys complexes. És una de les tècniques de separació més àmpliament utilisades, en aplicació en numeroses branques de la ciència i es basa en les diferències d'afinitat que tenen les molècules químiques quan entren en contacte i interaccionen en determinades substàncies que es troben en un llit estàtic, denominat comunament fase estacionaria. El nom de cromatografía líquida prové del fet de que els diferents components de la mescla que van a ser separats, fluïxen a través de la fase estacionaria transportats per un dissolvent líquit (aigua, metanol, cloroform, etc. o mescles de varis d'ells) que rep el nom de fase mòvil, que actua com eluyente. Menudes diferències de les interaccions entre els soluts i la fase estacionaria, fa que estos migren a diferent velocitat. Les substàncies que interaccionen menys, permaneixen més temps lliures en la fase mòvil alvançant més ràpidament en el fluir de la mateixa. Pel contrari, les que queden més unides a la fase estacionaria, per la seua major interacció, alvancen més llentament i per lo tant tardaran més en eixir. Si el llit en el que es troba la fase estacionaria és suficientment llarc, els components de la mescla poden aplegar a separar-se en la seua totalitat. La cromatografía líquida pot utilisar-se per a eliminar interferències, aïllar substàncies o purificar composts químics (cromatografía preparativa) o també pot utilisar-se en fins d'anàlisis químic (cromatografía analítica).

Tipos i modalitats de separació en cromatografía líquida

Existixen dos tècniques de separació per mig d'cromatografía líquida, basades en la forma en que es configura el llit de fase estacionaria:

Tanc d'cromatografía plana

Cromatografía plana. Dispositiu i desenroll d'un cromatograma

• Cromatografía plana. Si la fase estacionaria està sobre una superfície plana, generalment sobre un soport de vidre o làmina d'alumini, o si la mateixa fase estacionaria és un paper poroso especial. El fluix de la fase mòvil es conseguix per capilaridad. Pot ser de dos tipos:
  • Cromatografía en capa fina, (TLC).
  • Cromatografía en paper
• Cromatografía líquida en columna. La fase estacionaria es troba en l'interior d'un tubo cilíndric. El fluix de fase mòvil que circula a través de la fase estacionaria es conseguix per gravetat o per pressió per mig de bombeig del eluyente. És la forma més habitual d'cromatografía líquida.

En independència de que la separació es porte a terme en pla o en columna, les interaccions produïdes entre els soluts i la fase estacionaria, que permeten la separació d'estos, obedixen a diferents mecanismes físic-químics que al mateix temps donen nom a la tècnica cromatogràfica utilisada:

• Adsorció. La separació es basa en fenomens de superfície de tipo forces de Van der Waals i enllaces d'hidrogen. La fase estacionaria presenta centres actius en dipols permanents o induïts o també terminals en radicals -OH lliures. La modalitat o tècnica cromatogràfica basada en este mecanisme de separació rep el nom de cromatografía líquida d'adsorció.

• Repartiment. La fase estacionaria és un sòlit que conté un líquit fermament unit a ella, per lo que la separació es produïx com a conseqüència de la diferències de solubilidad dels soluts en la fase estacionaria i en la fase mòvil. Depenent de com es disponga la polaridad de la fase fase mòvil, existixen dos modalitats de cromatografía líquida de repartiment, la denominada en fase normal, si la fase mòvil és apolar (dissolvents orgànics, com hexano o similars) i la fase estacionaria una farcidura de tipo polar (alúmina, sílice, ...) o en fase inversa o reversa, si la fase mòvil utilisada és una mescla d'aigua en un dissolvent orgànic polar, com el metanol o el acetonitrilo, en el cas del qual la fase estacionaria té que ser apolar, generalment fases lligades químicament de octadecilsilano (C18) o de octilsilano (C8).
• Intercanvi iònic. Els analitos iònics positius s'intercanvien en els ions H⁺ presents en la fase estacionaria, que habitualment és una resina cambiadora de ions. Per a la separació de aniones es requerix una resina que intercanvie ions OH^-. En abdós casos, quant major és la càrrega o el radi iònic del solut, més retingut estarà per la fase estacionaria. Este mecanisme se separació dona lloc a la tècnica o modalitat cromatogràfica coneguda com a cromatografía de ions.
• Exclusió per tamanys. Utilisa fases estacionarias porosas en diàmetros controlat de poro. Segons el tamany mig del poro utilisat, les molècules molt grans a penes penetren en els poros, per lo que es eluyen a major velocitat, mentres que les molècules de diàmetros menys penetren més profundament, tardant més temps en ser eluídas. Per esta característica, la cromatografía líquida basada en este mecanisme es coneix com a cromatografía d'exclusió per tamany i és molt adequada per a la separació i estudi de proteïnes, polipèptits i unes atres biomoléculas de gran tamany. A voltes, quan s'ampra com a excloent una fase estacionaria de gel unflat, la modalitat cromatografía rep el nom cromatografía líquida de permeación de geles o de filtració en geles.
• Afinitat. Les fases estacionarias són sòlits que tenen units un lligant d'afinitat, com, per eixemple un inhibidor enzimàtic o un anticòs. Este mecanisme de separació té gran utilitat en algunes separacions de substàncies bioquímiques i dona lloc a la modalitat coneguda com a cromatografía líquida d'afinitat.

Metodologia generals

En cromatografía líquida en columna, existixen diferents métodos o formes d'arrastrar la mostra a través de  la columna per mig de la fase mòvil. Estos métodos s'utilisen en funció de l'interés particular que en cada cas vullga donar-se a la cromatografía líquida, variant de si s'utilisa en fins preparatius, per a aïllar un solut, concentrar-ho o com a cromatografía analítica. D'acort en les recomanacions de la IUPAC sobre nomenclatura en cromatografía, estes són:

• Cromatografía frontal. La mostra es fa passar de forma contínua per la columna que conté la fase estacionaria fins que termina el procés; és dir, la mostra actua com a fase mòvil.  La columna se satura en primer  lloc en el  solut  menys retingut,  que serà  el primer  en eixir. Transcorregut un temps, quan la columna se satura del següent solut menys retingut, per l'extrem de la columna comença a eixir una mescla del primer i el segon component i aixina  successivament. El temps (o el volum)  en el que es produïx  la  eixida d'un solut,  per  saturació,  és  el  temps  (o  el volum)  de  ruptura, i encara que pot  ser útil  en  fins  d'identificació, el principal interés d'este método de desenroll cromatogràfic és el de concentrar els soluts de la mostra o la neteja de la mateixa, eliminant interferentes, sobretot si estos són els soluts més retinguts.

• Cromatografía de desplaçament. La mostra s'introduïx al començ de la columna en un volum tal que no s'alcance la ruptura, és dir, que cap dels soluts d'interés ixca per l'atre extrem. Seguidament es fa passar una fase mòvil que conté un compost que va a ser fortament retingut, denominat desplazante. Este compost fa que els soluts retinguts en la columna fluïxquen cap a l'atre extrem de la mateixa, emergint primer els més fàcils de desplaçar que són els que menys interaccionen en la fase estacionaria. Depenent del volum de mostra introduït en la columna i de l'elecció del desplazante, es pot aplegar a obtindre els soluts relativament purs, per lo que este método de treball es  ampra en cromatografía  preparativa.
• Cromatografía de elución. En este procediment, la mostra es coloca al començ de la columna en un volum relativament menut, per a seguidament, fer passar la fase mòvil de forma contínua, que serà la que arrastre els components de la mostra. Estos es van distribuint a lo llarc de la columna en forma de bandes separades que van alvançant a través del llit cromatogràfic a diferents velocitats; mes ràpit les bandes corresponents als soluts que menys interaccionen en la fase estacionaria i més llentament quant major siga l'interacció. Si esta modalitat de treball es porta a terme en columnes grans, s'utilisa en fins preparatius, per a separar i aïllar els composts. Si s'ampra en columnes de menut tamany i diàmetro, la seua principal utilitat és l'analítica, és dir l'identificació i quantificació dels soluts.