Electroforesis d'afinitat
Electroforesis d'afinitat és un nom general per a molts métodos analítics utilisats en bioquímica i biotecnología. Es pot obtindre informació tant qualitativa com a quantitativa per mig de electroforesis d'afinitat. [1] La electroforesis creuada, el primer método de electroforesis per afinitat, va ser creat per Nakamura et al. Els complexos enzima-substrat s'han detectat per mig de electroforesis creuada. [2] [3] [4] [5] [6] Els métodos inclouen el cridat ensaig de canvi de movilitat electroforética, electroforesis per canvi de càrrega i electroforesis capilar d'afinitat. [1] Els métodos es basen en canvis en el patró electroforético de les molècules (principalment macromolécula) per mig d'interacció bioespecífica o formació de complexos. L'interacció o unió d'una molècula, carregada o descarregada, normalment canviarà les propietats electroforéticas d'una molècula. [7] [1] Les proteïnes de membrana poden identificar-se per mig d'un canvi en la movilitat
induït per un detergent carregat. Els àcits nucleicos o fragments de àcit nucleicos poden caracterisar-se per la seua afinitat en atres molècules. Els métodos s'han utilisat per a l'estimació de constants d'unió, com per eixemple en electroforesis d'afinitat de lectina o caracterisació de molècules en característiques específiques com a contingut de glucano o unió a lligant. [1] Per a enzimes i atres proteïnes d'unió a ligandos, es pot utilisar electroforesis unidimensional similar a la contraelectroforesis o a la "inmunoelectroforesis en eixida", o la electroforesis d'afinitat com una quantificació alternativa de la proteïna. [8] Alguns dels métodos són similars a la cromatografía d'afinitat per mig de l'us de ligandos immovilisats.
Tipos i métodos
[editar | editar còdic]Actualment, s'estan realisant investigacions per a desenrollar noves formes d'utilisar el coneiximent ya associat en la electroforesis d'afinitat per a millorar la seua funcionalitat i velocitat, aixina com intents de millorar els métodos ya establits i adaptar-los per a realisar tasques específiques.
Electroforesis en gel de agarosa
[editar | editar còdic]
Un tipo d'ensaig de canvi de movilitat electroforética (AMSA), la electroforesis en gel de agarosa s'utilisa per a separar els complexos d'aminoàcits units a proteïnes dels aminoàcits lliures. Usant un voltage baix (10 V/cm) per a minimisar el risc de dany per calor, l'electricitat passa a través d'un gel de agarosa. Quan es dissol en una solució tamponada calenta (50 a 55 graus Celsius), produïx una solució viscosa, pero quan es gela, es solidifica com un gel. Per mig d'este método se separen les proteïnes séricas, la hemoglobina, els àcit nucleicos, els productes de la reacció en cadena de la polimerasa, etc. Els grups sulfat fixos de agarosa poden provocar una electroendosmosis millorada, lo que reduïx la resolució de la banda. L'us de gel de agarosa ultrapuro en poc contingut de sulfat pot evitar açò.
Electroforesis ràpida en gel de agarosa
[editar | editar còdic]Esta tècnica utilisa un alt voltage (≥ 20 V/cm) en un tampó Tris-borat 0,5× a través d'un gel de agarosa. [9] Este método es diferencia de la electroforesis en gel de agarosa tradicional en utilisar un voltage més alt per a facilitar un temps d'eixecució més curt i produir una resolució de banda més alta. Atres factors inclosos en el desenroll de la tècnica de electroforesis ràpida en gel de agarosa són la gruixa del gel i el percentage de agarosa dins del gel.
Electroforesis d'afinitat de boronato
[editar | editar còdic]La electroforesis per afinitat de boronato utilisa geles d'acrilamida en infusió d'àcit borónico per a purificar NAD-RNA. Esta purificació permet als investigadors medir fàcilment l'activitat cinètica de les enzimes decapadoras de NAD-RNA. [10]
Electroforesis capilar d'afinitat
[editar | editar còdic]La electroforesis capilar d'afinitat (ACE) es referix a una série de tècniques que es basen en interaccions d'unió específiques i no específiques per a facilitar la separació i la detecció a través d'un enfocament de formulari d'acort en la teoria de l'electromigración. [11] [12] Utilisant les interaccions intermoleculars entre molècules que ocorren en solució lliure o movilisades sobre un soport sòlit, ACE permet la separació i quantificació de concentracions de analitos i constants d'unió i dissociació entre molècules. [13] [14] Com sondes d'afinitat en CAE, s'ampren composts marcats en fluoróforos en afinitats per les molècules diana. [15] En ACE, els científics esperen desenrollar candidats a fàrmacs d'unió forta, comprendre i medir l'activitat enzimàtica i caracterisar les càrregues de les proteïnes. [16] La electroforesis capilar d'afinitat es pot dividir en tres tècniques distintes: electroforesis de no equilibri de mescles de mostres equilibrades, ACE d'equilibri dinàmic i ACE basada en afinitat. [13]
La electroforesis en desequilibri de mescles de mostres equilibrades s'utilisa generalment en la separació i l'estudi d'interaccions d'unió de proteïnes grans i implica combinar tant el analito com la seua molècula receptora en una mostra premezclada.
Estes molècules receptores a sovint prenen la forma de sondes d'afinitat que consistixen en molècules marcades en fluoróforos que s'uniran a les molècules objectiu que es mesclen en la mostra que s'està analisant. [13] Esta mescla i els seus complexos posteriors se separen després per mig de electroforesis capilar. [13] Degut a que la mescla original de analito i molècula receptora estaven unides en equilibri, la llenta dissociació d'estes dos molècules unides durant l'experiment electroforético donarà com resultat la seua separació i un canvi posterior en l'equilibri cap a una major dissociació. [17] El patró de taca característic produït per la llenta lliberació del analito del complex durant l'experiment es pot utilisar per a calcular la constant de dissociació del complex. [17]
La ACE d'equilibri dinàmic implica la combinació del analito que es troba en la mostra i la seua molècula receptora que es troba en la solució tamponada en el tubo capilar de modo que l'unió i la separació solament ocorren en l'instrument. [13] Per a la electroforesis capilar d'afinitat en equilibri dinàmic se supon que l'unió lligant-receptor es produïx ràpidament quan es mesclen el analito i el tampó. Les constants d'unió generalment es deriven d'esta tècnica basant-se en el canvi de migració màxima del receptor que depén de la concentració del analito en la mostra. [13]
La electroforesis capilar basada en afinitat, també coneguda com a cromatografía de electroafinidad capilar (CEC), implica l'unió del analito en la mostra a una molècula receptora immovilisada en la paret capilar, microperlas o microcanales. [18] CEC oferix la major eficàcia de separació de les tres tècniques ACE, ya que els components de la mostra sense matriu s'eliminen per llavat i després el lligant es llibera i analisa. [13]
La electroforesis capilar d'afinitat aprofita les ventages de la electroforesis capilar i les aplica a l'estudi de les interaccions de proteïnes. [16] ACE és ventajós perque té una alta eficiència de separació, té un temps d'anàlisis més curt, pot eixecutar-se a pH fisiològic i implica un baix consum de lligant/molècules. [19] [20] Ademés, no és necessari conéixer la composició de la proteïna d'interés per a realisar estudis de ECA. [16] No obstant, la principal desventaja és que no proporciona molta informació estequiomètrica sobre la reacció que s'està estudiant. [20]
Electroforesis en gel de poliacrilamida en trampa d'afinitat
[editar | editar còdic]La electroforesis en gel de poliacrilamida en trampa d'afinitat (PAGE) s'ha convertit en un dels métodos més populars de separació de proteïnes. Açò no solament es deu a les seues qualitats de separació, sino també a que pot usar-se junt en una varietat d'atres métodos analítics, com l'espectrometria de masses i la transferència Western. [14] Ademés d'ajudar a aïllar i purificar proteïnes de mostres biològiques, es preveu que AT-PAGE siga útil en anàlisis de variacions en l'expressió de proteïnes particulars, aixina com en investigacions de modificacions postraduccionales de proteïnes. [21] Este método utilisa un enfocament de dos passos. Primer, es passa una mostra de proteïna a través d'un gel de poliacrilamida per mig de electroforesis. Després, la mostra es transferix a un gel de poliacrilamida diferent (el gel trampa d'afinitat) a on s'immovilisen les sondes d'afinitat. Les proteïnes que no tenen afinitat per les sondes d'afinitat passen a través del gel de trampa d'afinitat, i les proteïnes en afinitat per les sondes quedaran "atrapades" per les sondes d'afinitat immòvils. Després, estes proteïnes atrapades es visualisen i identifiquen per mig d'espectrometria de masses despuix de la digestió en gel. [14]
Electroforesis per afinitat en fosfat
[editar | editar còdic]La electroforesis d'afinitat en fosfat utilisa una sonda d'afinitat que consistix en una molècula que s'unix específicament a ions de fosfat divalentes en una solució acuosa neutra, coneguda com "Phos-Tag". Este método també utilisa un gel de separació fet d'un monòmer Phos-Tag colgante de acrilamida que està copolimerizado. Les proteïnes fosforiladas migran llentament en el gel en comparació a les proteïnes no fosforiladas. Esta tècnica brinda a l'investigador la capacitat d'observar les diferències en els estats de fosforilación de qualsevol proteïna determinada. [14] Esta tècnica permet la detecció de bandes distintes inclús en molècules de proteïnes que tenen la mateixa cantitat de residus d'aminoàcits fosforilados pero que estan fosforilados en diferents ubicacions d'aminoàcits. [22] [23]
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ 1,0 1,1 1,2 1,3 Proteomes.3(1)
- 42–55.ISSN 2227-7382.doi:10.3390/proteomes3010042.
- ↑ Nature.184(4686)
- 638–639.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/184638a0.
- ↑ Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie.328(Jahresband)
- 139–144.ISSN 0018-4888.doi:10.1515/bchm2.1962.328.1.139.
- ↑ Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie.334(Jahresband)
- 95–102.ISSN 0018-4888.doi:10.1515/bchm2.1963.334.1.95.
- ↑ Archives of Biochemistry and Biophysics.153(1)
- 1–7.doi:10.1016/0003-9861(72)90413-4.
- ↑ Clinica Chimica Acta.57(1)
- 45–54.doi:10.1016/0009-8981(74)90176-4.
- ↑ Electrophoresis.39(2)
- 344–347.doi:10.1002/elps.201700207.
- ↑ TrAC Trends in Analytical Chemistry.48
- 112–131.doi:10.1016/j.trac.2013.04.005.
- ↑ Analytical Biochemistry.511
- 36–41.doi:10.1016/j.ab.2016.07.027.
- ↑ Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology, Heidelberg University, 69120 Heidelberg, Germany.
- ↑ (2016).Analytical and Bioanalytical Chemistry.408(30)
- 8623–8641.doi:10.1007/s00216-016-9799-i.
- ↑ Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.222
- 115089.doi:10.1016/j.jpba.2022.115089.
- ↑ 13,0 13,1 13,2 13,3 13,4 13,5 13,6 Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications.715(1)
- 29–54.ISSN 0378-4347.doi:10.1016/S0378-4347(98)00258-8.
- ↑ 14,0 14,1 14,2 14,3 Proteomes.3(1)
- 42–55.doi:10.3390/proteomes3010042.
- ↑ Analytical Chemistry.66(1)
- 9–15.ISSN 0003-2700.doi:10.1021/ac00073a004.
- ↑ 16,0 16,1 16,2 Accounts of Chemical Research.28(11)
- 461–468.ISSN 0001-4842.doi:10.1021/ar00059a004.
- ↑ 17,0 17,1 Journal of Biomolecular Screening.11(2)
- 115–122.ISSN 1087-0571.doi:10.1177/1087057105284339.
- ↑ Electrophoresis.35(10)
- 1469–1477.doi:10.1002/elps.201300549.
- ↑ Analytical Chemistry.91(1)
- 372–387.ISSN 0003-2700.doi:10.1021/acs.analchem.8b04741.
- ↑ 20,0 20,1 «[1]». Consultat el 2019-12-13 (en en-US).
- ↑ Analytical Chemistry.82(2)
- 755–761.ISSN 0003-2700.doi:10.1021/ac902290q.
- ↑ Electrophoresis.30(3)
- 550–559.doi:10.1002/elps.200800386.
- ↑ Proteomics.8(15)
- 2994–3003.doi:10.1002/pmic.200800243.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Electroforesis de afinidad» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.