Electroforesis en gel

Archiu:Gel electrophoresis 2.jpg

Electroforesis en gel

Archiu:CAPS 0 .png

Gel de electroforesis.

La electroforesis en gel és un grup de tècniques empleades pels científics per a separar molècules basant-se en propietats com el tamany, la forma o el punt isoeléctrico. l'electroforesis en gel s'utilisa generalment en propòsits analítics, pero pot ser una tècnica preparativa per a purificar molècules parcialment abans d'aplicar espectrometria de massas, PCR, clonació o seqüenciació de ADN.

Significat

Archiu:Electroforesis. CAPS 3

Esquema de preparació d'un gel de electroforesis horisontal. La placa que s'observa s'introduïx a continuació en una cubeta reblix de tampó de electroforesis i conectada als electrodos.

La segona part del núcleu, gel es referix a la matriu usada per a separar les molècules. En molts casos un gel és un polímero entrellaçat de porosidad controlable. Quan la separació és de proteïnas, ADN o àcits nucleicos menuts (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel està compost per diferents concentracions d'acrilamida/bis-acrilamida i un iniciador de la polimerisació, per a produir rets de poliacrilamida de diferents tamanys. Per a separar àcits nucleicos grans (més d'uns centenars de bases), la matriu amprada és agarosa purificada. En abdós casos, el gel forma una matriu sòlida pero porosa. La acrilamida, en contrast en la poliacrilamida, és una neurotoxina i deu ser manipulada en precaució.

La primera part del nom, electroforesis, es referix a la força electromotriz que és amprada per a desplaçar les molècules a través del gel. En situar les molècules en el gel i aplicar una diferència de potencial elèctric, les molècules es mouen a diferents velocitats, cap al càtodo, si estan carregades positivament, i cap al ànodo, si estan carregades negativament (en una electroforesis, els electrodos es comporten igual que en una cubeta electrolítica).

Aplicacions

Àcits nucleicos

En els àcit nucleicos la direcció de migració és de l'electrodo negatiu al positiu, i açò és per la càrrega negativa present en l'esquelet sucre-fosfat. En els fragments d'ADN dobles (en estructura de doble hèliç) la velocitat de migració és inversamente proporcional al seu tamany. En fragments simples d'ADN i ARN (una sola cadena), dites molècules tendixen a plegar-se de forma complexa i a migrar de forma més complicada, segons l'estructura terciaria formada despuix del plegament. No obstant, composts que puguen trencar els enllaços de pont d'hidrogen, com el hidròxit de sodi o la formamida, són amprats per a 'desplegar' les molècules plegades i permetre que la velocitat de migració depenga únicament i exclusivament del tamany i no de l'estructura formada despuix del plegament.

Proteïnes

Les proteïnas no tenen una estructura predible com els àcit nucleicos, i per tant les seues velocitats de migració no són similars entre les proteïnes. Inclús pot ser que no migren ni en aplicar una força electromotriz (en trobar-se en la seua punt isoeléctrico). En estos casos, les proteïnes es desnaturalizan per mig de l'adició d'un detergent com el dodecilsulfato sòdic/dodecilfosfato sòdic (SDS/SDP) i un agent reductor com el 2-mercaptoetanol. Els detergents otorguen una càrrega neta negativa a la proteïna que els permet migrar a través del gel de poliacrilamida en relació directa a la seua massa, ya que la cantitat de càrregues negatives que s'unixen a la proteïna depén del tamany d'esta, existint una relació carrega/massa similar. Per un atre costat, l'agent reductor trenca els enllaços disulfuros, separant a la proteïna en les seues subunidades. Ademés, la desnaturalización fa que perguen la seua estructura terciaria i cuaternaria per tant la seua velocitat de migració és proporcional al tamany i no a la seua estructura terciaria ni a la seua interacció en atres macromolécula. Aixina, els més grans es desplacen més llentament.