Hibridació (biologia molecular)

La hibridació d'àcits nucleicos (ADN o ARN) és un procés pel qual es combinen dos cadenes d'àcits nucleicos per a crear a un híbrit en capacitats destarifades antiparalelas i en seqüències de bases complementàries en una única molècula de doble cadena, que pren l'estructura de doble hèliç, a on les bases nitrogenades queden amagades en l'interior. Açò fa que si irradiamos la mostra en la llongitut d'ona a la que absorbixen estes bases (260 nm), l'absorció d'energia serà molt menor si la cadena és doble que si es tracta de la cadena senzilla, ya que en esta última els dobles enllaços de les bases nitrogenades, que són les que capten l'energia, estan totalment exposts a la font emissora d'energia. El seu coneiximent també ha fet possible el desenroll d'una tècnica molt útil, cridada hibridació in situ.

Els nucleòtits s'uniran en els seus complementaris baix condicions normals: A=T; A=O; C≡G; G≡C; T=A o O=A

Aixina que dos cadenes perfectament complementàries s'uniran l'una a l'atra ràpidament. Pel contrari, per les diferents geometria dels nucleòtits, una simple variació de les parelles anteriors du a inconsistencias entre les cadenes i dificultarà l'unió.

El procés d'hibridació no es pot revertir simplement calfant la dissolució que conté la molècula. El percentage de GC dins de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento i de desnaturalización ya que G s'unix a C per mig de tres ponts d'hidrogen i A s'unix a O o T per mig de dos ponts d'hidrogen; per tant, i ya que es requerix més energia per a trencar tres enllaços que per a trencar dos, dita energia es traduïx en una major temperatura. El %GC no és igual per a totes les espècies, és més, el %GC és distint inclús entre el ADN nuclear i el ADN mitocondrial, lo que nos dona prou joc en els protocols d'extracció de ADN, segons quin tipo anem a estudiar i açò és important, entre atres motius perque existixen malalties genètiques degudes a mutacions en el ADN mitocondrial.

En biologia molecular experimentalment es porten a terme dos tipos diferents d'hibridació: Tipo Southern, per a unions ADN-ADN i tipo Northern blot, per a unions ADN-ARN.

1. L'hèliç de doble cadena (ADN) se separa per mig d'un procés físic (calor) o químic (en una base forta, com la moixa càustica). Açò trenca els enllaços per pont d'hidrogen que mantenen unides els dos bri de el ADN.
2. Els dos bri complementàries se separen, el ADN es desnaturaliza.
3. Una mostra de cadenes simples (o desnaturalizadas) es mescla en una atra mostra de cadenes simples.
4. La mostra combinada es gela llentament, les molècules senzilles es van emparellant per les zones complementàries (més estables termodinàmicament) i es va formant una nova molècula hibridada

La velocitat d'hibridació és un indicatiu de la similitut genètica entre les dos mostres. El percentage de similitut genómica i la velocitat d'hibridació és directament proporcional.

Métodos de laboratori

Existixen tres tipos d'hibridacions d'àcits nucleicos que s'usen freqüentment en els laboratoris que utilisen tècniques de biologia molecular.

Abdós métodos utilisen una cadena senzilla de ADN marcada per un método físic-químic, be siga en radiactivitat o be en un fluorocromo. Esta cadena té una seqüència de nucleòtits coneguda i s'utilisa com sonda per a detectar atres molècules de ARN o ADN de cadena senzilla de seqüència pareguda.

Southern

El método tipo Southern o Southern blot va ser desenrollat per a la detecció de gens específics en el ADN celular.

El ADN és digerit en una enzima de restricció i els fragments són separats per tamanys per mig d'electroforesis en un gel. A continuació els fragments de ADN de doble cadena són desnaturalizados per mig d'un procés químic separant els dos bri components de el ADN en les seues cadenes senzilles. Posteriorment, el ADN inserte en el gel és transferit a un filtre de nitrocelulosa, en lo que en el filtre queda representada una rèplica de la disposició dels fragments de ADN presents en el gel. A continuació el filtre es incuba durant un temps en la sonda marcada (radiactivamente o en un fluorocromo); durant l'incubació la sonda es va hibridando en les molècules de ADN de cadena senzilla de seqüència complementària (o molt pareguda). La sonda unida al fragment de ADN complementari es pot visualisar en el filtre d'una forma senzilla per mig d'una exposició a una película de rajos X per al cas de sondes radiactives o en una película sensible a la llum, per al cas de sondes en fluorocromo

Northern

El segon método, tipo Northern blot o Northern, s'utilisa per a identificar les cadenes de ARN de seqüència semblant a el ADN que s'usa com sonda; a diferència del tipo Southern que s'utilisa per a identificar ADN, el método Northern servix per a identificar ARN.

El ARN s'extrau i es fracciona en tamanys variables per mig d'una electroforesis en gel de poliacrilamida en unes condicions que mantinguen les cadenes de ARN en estat desnaturalizado. El procés continua de forma semblant a l'hibridació de tipo Southern. El método del Northern s'utilisa molt freqüentment per a realisar estudis d'expressió gènica; per a conéixer qué gens estan actius formant ARN mensager en quines condicions, en quins teixits o tipos celulars.

Hibridació in situ

Un desenroll de les tècniques de preparació i fixació de materials biològics per a la seua observació al microscopi, junt en el desenroll de tècniques d'hibridació tipo Northern ha dut a poder realisar l'hibridació de les sondes directament sobre teixits de material orgànic. Utilisant tècniques inmunohistoquímicas es pot conéixer la localisació precisa dels teixits i cèlules que estan expressant els gens de seqüència complementària a les sondes utilisades. També en esta categoria destaca el FISH, tècnica d'hibridació in situ, a on les sondes són seqüències de ADN marcades que s'unixen a seqüències de ADN conegudes dins del cromosoma, en les que compartix un alt grau de similitut i que podem observar en un microscopi òptic de fluorescència.

Chip de ADN

El següent pas en el desenroll de tècniques d'hibridació ha dut a la miniaturisació dels filtres d'nitrocelulosa i a l'utilisació de matrius microscòpiques en forma de chip de ADN. D'esta manera es poden colocar en una matriu una immensa cantitat de còpies gèniques diferents i per mig d'un procés d'hibridació detectar totes aquelles que tenen una seqüència pareguda. Modificant les característiques de les molècules presents en la matriu aixina com canviant les sondes utilisades, les possibilitats d'anàlisis d'expressió que proporcionen els chips de ADN són enormes.