Hibridació in situ

Archiu:Caps block 0 HtechniqueInt. caps block 1

Figura 1. Esquema d'hibridació in situ

La hibridació in situ (ISH) és una tècnica que s'utilisa per a la localisació i la detecció de seqüències de ADN i de ARN específiques en les cèlules, cromosomes o teixits preservats, per mig de la formació d'una molècula híbrida entre una molècula endógena de ARN o ADN de la cèlula i una sonda complementària de ARN o d'ADN monocatenario. La tècnica d'hibridació in situ es basa en la capacitat que posseïxen els àcits nucleicos per a hibridarse entre sí, és dir, l'existència de determinada seqüència d'ADN o ARN, que resulta complementària en una atra seqüència. La seua utilitat residix en la capacitat de poder demostrar per mig de l'utilisació d'una sonda (formada per una seqüència d'ADN prèviament coneguda) marcada en un isòtop radiactiu, la presència de determinada seqüència d'ADN o ARN complementària, en la mostra a estudiar. Quan una dels dos bri està marcat, els híbrits reconeguts poden ser detectats per varis métodos, que poden ser fluorescent i no fluorescent. La detecció in situ permet visualisar de forma directa l'ubicació espacial de seqüències específiques, com s'observa en la Figura 1, la qual cosa és essencial per a dilucidar l'organisació i funció gènica, per açò esta tècnica és de gran importància en diversos camps, entre els quals es troba el diagnòstic de rearreglos cromosomaels, la detecció d'infeccions virals i l'anàlisis de la funció gènica durant el desenroll embrionari.

Història

La tècnica es va desenrollar en l'any de 1969 per dos grups d'investigació, Gall i Pardue i independentment per Jonh et al, en el mateix any. Gall i colaboradors varen descriure una tècnica en la qual es formaven híbrits moleculars entre RNA i DNA. La tècnica va ser portada a terme en ovòcits de Xenopus laevis, per mig de la hibridació de rRNA en rDNA extracromosomal; en els quals varen detectar la localisació diferencial dels híbrits d'àcits nucléicos a distints estadis usant microautoradiografia. Esta tècnica es va caracterisar per permetre que la seqüència de àcit nucleicos fora detectada dins de la cèlula sense alterar la morfologia celular o l'integritat dels seus compartimento. L'us d'Hibridació in situ per a "contar i identificar organismes" va ser propost per Olsen, i després introduïda a la bacteriologia en l'any 1988 pel grup de Giovannoni, els qui varen anar els primers en utilisar sondes d'oligonucleótidos marcades radioactivamente i dirigides a el ARNr, per a la detecció microscòpica de bactèries.

Fonamente

L'objectiu de l'hibridació in situ és determinar la presència o absència de seqüències de DNA o RNA d'interés, aixina com localisar estes seqüències en cèlules específiques o llocs cromosòmics. Condicions òptimes per a l'hibridació d'extractes purificats de DNA o RNA en soports sòlits han segut arduamente estudiades. En l'us de mostres tisulares i celulars; no obstant, nous problemes tals com l'unió no específica de les sondes han segut trobats. La sensibilitat de l'hibridació in situ depén de les següents variables: la preparació de la mostra (teixit o cèlula), construcció de la sonda, etiquetat de la sonda i la sensibilitat del método usat per a la detecció.

1. Preparació de la mostra: Un pretratamiento pot ser portat a terme abans d'hibridació per a aumentar l'eficiència i reduir la tinción no específica. El tractament en proteasas (proteinasa K la més comuna) facilita l'accés cap a la seqüència objectiu. l'acetilación en 0,25% d'anhídrit acètic o 0.1 M trietanolamina reduïx l'unió de les sondes en el teixit. L'optimisació de la preparació de la mostra, inclós la fixació i l'almagasenament, és important per a la detecció intracelular de àcit nucleicos. La fixació necessita preservar el DNA o RNA i la morfologia del teixit. En contrast, els processos de síntesis i degradació enzimàtica de DNA o RNA deuen mantindre's estables, per lo tant el promig de vida del mRNA és un factor important. En este context, el teixit a ser fixat deu congelar-se tan pronte siga possible despuix de la seua escissió, el temps entre l'escissió i fixació es pren en conte al moment d'interpretar els resultats. S'utilisa para-formaldehit per a la fixació, en alguns casos seguit per l'adició de glutaraldehido. La fixació de certs teixits es veu favorida per mescles d'àcit acètic-alcohol o el fijador de Bouin.
2. Construcció de la sonda: Diferents tipos de sondes tals com cDNA, cRNA i oligonucleótidos sintètics s'utilisen per a l'hibridació in situ. L'elecció de la sonda dependrà de la sensibilitat i especificidad, facilitat de producció, facilitat de la sonda per a penetrar el teixit, aplicació i la reproducibilidad del método. El tamany òptim de la sonda és 50-300 nucleòtits.
3. Etiquetat de la sonda: L'etiquetage de la sonda pot realisar-se per mig de l'incorporació de radioisòtops ( ³H, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I ) o marcadors no radioactivos (biotina, anticossos específics, entre uns atres). L'us de marcadors radioactivos es considera el método més sensible. Els llocs d'hibridació poden visualisar-se per mig de radiografia en rajos-X o emulsions líquides.
4. Sensibilitat del método: en funció de la sonda utilisada i la seqüència d'interés distintes reaccions de control poden portar-se a terme tals com Northern blot o Southern blot, Inmunoquimica, hibridació en fragments de seqüència coneguda, entre uns atres.