N-glicosilación

La N-glicosilación consistix en l'adició en un residu d'asparagina d'una proteïna d'una cadena d'oligosacàrits de complexitat variable. És un procés conservat que implica la participació de numerosos components i que dona lloc a una gran varietat d'estructures finals.

Generalitats

1. Proteïnes presenten seqüència consens de N glicosilación: necessària pero no suficient. En general esta seqüència sol ser –N-X-S/T (X no pot ser prolina).
2. Precursor lipídico en el que es pre-ensambla un core, evolutivamente conservat, compost per 14 sacáridos: (Glc)3(Man)9(GlcNAc)2.
3. OST (oligo sacaril transferasa): complex proteic encarregat de transferir el core des del precursor lipídico a un residu de asparagina de la seqüència consens de la proteïna. Esta transferència té lloc en el lumen de RER mentres la proteïna està sent sintetisada i, per tant, abans de plegar-se. La N-glicosilación supon, per tant, una modificació cotraduccional.
4. Processament del core: s'inicia en el RE i culmina en el AG. Consistix en l'eliminació de tots els residus de glucosa i varis de manosa.
5. Elongació de la porció glucídica: té lloc en el AG. Una volta terminada la proteïna és transportada al seu destí final.

Seqüència consens de N glicosilación

L'adició de la porció glicana a una glicoproteína no es realisa sobre qualsevol aminoàcit, sino que està dirigida a unes seqüències concretes, les denominades seqüències consens. En N-glicosilación estàs seqüències estan més conservades que en O-glicosilacion. La seqüència consens més representativa per a N-glicosilación està composta per –N-X(llevat P)-S/T, a on la N és el residu a on s'incorporarà el core tetradecascárido. No obstant, a pesar de ser la seqüència consens majoritària no és l'única existent ya que de forma recent s'han descrits N-glicosilaciones en el residu N de les seqüències –N-G- , -N-X-C i -N-X-V. Totes estes seqüències solen trobar-se ubicades en girs i loops lo que els fa accessibles per a la transferència del core per part del complex OST.

L'aproximació experimental que es va seguir per a postular estes noves seqüències va consistir en mapear de 6367 llocs de glicosilación. En primer lloc es varen purificar pèptids glicosilados gràcies a columnes d'afinitat que contenien diversos tipos de lectina (proteïnes d'unió a sacáridos de la porció glicana). Posteriorment es va procedir a la separació de les partix proteïnes i glicana digerint en l'enzima PNGase F i finalment analisant els pèptids en espectrometria de masses. El punt clau d'este estudi es troba en la digestió realisada en PNGase F. Esta enzima curta de forma específica en l'enllaç que unix el residu de Asn en la part glicídica. Este brot resulta en la modificació de Asn, que passa a Asp.

Esta digestió es va realisar tant en aigua 18 O (pesada) com sense ella. La digestió en presència d'este tipo d'aigua, suponia l'incorporació d'àtoms de oxigen pesats, que en l'anàlisis per espectrometria de masses resultaven en un increment de 2.9 Dona, permetent identificar els residus que havien segut processats per la PNGase, és dir, aquells que estaven modificats. Adicionalment també permetia diferenciar els residus que havien segut digerits d'aquells que s'havien desaminado de forma espontànea.