Ultracentrifugación
La centrifugación diferencial és un procediment comú en microbiologia i citologia, usat per a separar alguns dels orgànuls que formen part de la cèlula per a un anàlisis posterior de parts específiques de les cèlules. En el procés, primer es homogeneiza una mostra de teixit per a trencar les membranes celulars i mesclar els continguts de les cèlules. Després, esta mescla homogénea és somesa a repetides centrifugación, cada volta retirant el sediment, i a continuació incrementant successivament la força centrífuga aplicada al sobrenadante de l'etapa anterior. Finalment, la purificació deu fer-se per mig de sedimentación d'equilibri, i la capa desijada s'extrau per a un futur anàlisis.
La separació està basada en el tamany i la densitat, a on les partícules més grans i denses són sedimentadas en centrifugación de poca força. Per eixemple, les cèlules completes no homogeneizadas sedimentan en centrifugación en poca força i duració curta com 1000×g durant 5 minuts. Els fragments més menuts de les cèlules i els orgànuls permaneixen en el líquit sobrenadante i requerixen més força centrífuga i més temps per a sedimentar. En general, un pot enriquir (separar o concentrar) els següents components de la cèlula en este orde:
- Cèlules completes i núcleus;
- Mitocondria, lisosomas i peroxisomas;
- Microsoma (vesícules del retícul endoplasmático); i
- Ribosoma i citosol.
Preparació de la mostra
[editar | editar còdic]Ans que la centrifugación diferencial puga portar-se a terme per a separar diferents components de la cèlula, el teixit de mostra deu homogeneizarse. En este procés s'usen una licuadora i una peça de porcelana porosa de la mateixa forma i dimensió que el contenidor. El contenidor és, en la majoria dels casos, un tubo d'ebullició de vidre.
Primer, el teixit de mostra és triturado i una solució amortiguadora li és afegida, formant una suspensió líquida de teixit de mostra triturado. La solució amortiguadora és una solució acuosa, densa i inerte, que és dissenyada per a suspendre la mostra en un mig líquit sense danyar-la per reaccions químiques o osmóticas. En la majoria dels casos, la solució usada és de sacarosa, en uns atres, és usada una solució de salmorra. Després, la licuadora, conectada a un rotor d'alta velocitat, és insertada en el contenidor que du la mostra, pressionant la mostra de teixit triturado contra les parets del contenidor.
En el rotor encés, la mostra de teixit és mòlta en menuts fragments pels poros de la porcelana i les parets del contenidor. Este procés de molimiento trencarà les membranes celulars de les cèlules en el teixit de mostra, deixant orgànuls individuals suspesos en la solució. Este procés és anomenat homogeneïsació. Una porció de cèlules permaneixeran intactes despuix de moldre la mostra, i alguns orgànuls seran afectats, i d'estos, s'encarregaran les pròximes etapes d'centrifugación.
Ultracentrifugación
[editar | editar còdic]La mostra homogeneizada ara està llista per a la centrifugación en una ultracentrifugadora. Una ultracentrifugadora consistix en una cambra al buit i refrigerada que conté un rotor, el qual és manejat per un motor elèctric capaç de girar a alta velocitat. Les mostres són ubicades en tubos que es troben dins del rotor o subjectes a est. La velocitat rotacional pot alcançar més de 100.000 rpm per al model “floor”, 150.000 rpm per al model “bench-top” (Beckman Optima Max-XP), generant forces centrífugas entre 800.000×g i 1.000.000×g . Esta força causa la sedimentación d'macromolécula i inclús pot causar una distribució no uniforme de molècules menudes.
Com els diferents fragments de la cèlula tenen diferents tamanys i densitat, cada fragment es va a depositar en un precipitat en diferents forces centrífugas mínimes. D'esta manera, la separació de la mostra en diferents capes pot realisar-se per mig d'un primer centrifugado de la mostra homogénea original baixe forces dèbils, retirant el precipitat, i posteriorment exponent les subsecuentes fases sobrenadantes a camps centrífugos cada volta majors. Cada volta, una porció de diferent densitat és precipitada a la part inferior del tubo i és extreta. La repetida aplicació d'este procés produïx un ranc de capes que inclou diferents parts de la mostra original. Alguns passos adicionals poden realisar-se per a refinar encara més cada u dels precipitats obtinguts. La sedimentación depén de la massa, la forma i el volum específic parcial d'una macromolécula, aixina com també de la densitat del solvent, el tamany del rotor i la taxa de rotació. La velocitat de sedimentación pot ser monitoreada durant l'experiment per a calcular la massa molecular, aixina com el coeficient de sedimentación. Valors grans de S (major taxa de sedimentación) corresponen a un major pes molecular. Partícules més denses es sedimentan a major velocitat. Les proteïnes llargues tenen majors coeficients de fricció i es sedimentan més llentament per a assegurar major precisió.
Referències
[editar | editar còdic]- Este artícul conté una traducció derivada de «Ultracentrifugación» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.