Vector de clonació

Els vectores de clonació o vector molecular són molèculas transportadoras que transferixen i repliquen fragments de ADN que duen insertats per mig de tècniques de ADN recombinante. Per a que servixca de vector, una molècula deu ser capaç de replicar-se junt en el fragment de ADN que transporta. També té que tindre seqüències de reconeiximent que permeten l'inserció del fragment de ADN a clonar.

Per a insertar un fragment de ADN a un vector, s'utilisa una enzima de restricció que es mescla en fragments de ADN produïts en la mateixa enzima, posteriorment, es adiciona l'enzima Fosfatasa Alcalina, la qual és l'encarregada d'evitar la recircularización del vector, ya que adiciona un extrem 3' Fosfat que evita l'unió d'abdós extrems aixina com la complementarietat i formació d'un enllaç fosfodiéster. Immediatament es adiciona el ADN que pretén insertar-se en el vector, a on un dels extrems s'unix per complementarietat i s'utilisa una ligasa per a generar l'unió i la seua recircularización.

Els vectores que transporten un fragment insertat es denominen vectores recombinantes.

Tot vector de clonació deu contindre els següents elements:

• Orige de Replicació: És la regió que codifica per a l'inici de la síntesis de ADN, el qual li dona la qualitat de poder replicar-se de manera independent a el ADN cromosòmic, ya siga en un sistema bacterià o en un sistema d'expressió en rent.

• Agent de Selecció: Són gens continguts en la seqüència del vector, els quals li conferixen característiques adicionals al sistema de clonació (bactèries, rent, etc.), que permeten l'identificació i selecció de les clones recombinantes, és dir, clones que contenen el fragment de ADN d'interés. Eixemples d'açò són els gens que codifiquen per a la resistència a antibiòtics, com lo són els de resistència a la ampicilina o a la tetraciclina, o pel contrari, poden ser marcadors metabòlics com el gen Lac Z, que codifica per a la síntesis de l'enzima beta galactosidasa o marcadors auxotróficos, com lo és el gen que codifica per a la síntesis de histidina (molt utilisat en els sistemes d'expressió i clonació en rent).

• Polilinker o Lloc de Multiclonación: Regió continguda dins de les seqüències dels gens que codifiquen per als marcadors, que contenen múltiples llocs de restricció, és dir, múltiples llocs de reconeiximent per a les enzimes de restricció, que permeten l'inserció dels fragments de ADN que es desija clonar en un sistema.

Tipos de vectores

Plásmidos

Els plásmidos varen ser els primers vectores que es varen desenrollar, i encara són àmpliament usats. Estos vectores procedixen de molècules de ADN de doble cadena extracromosómicas que es troben de manera natural i que es repliquen autónomamente dins de les cèlules bactèrianas.

Archiu:E.coli CAPS 12 + pU CAPS 13 .jpg

Sembra d'un cultiu de cèlules en un mig en ampicilina i x-gal de E. coli JM83 transformades per a introduir el plásmido pUC18

pUC18

És un plásmido molt utilisat, ya que presenta unes característiques que són molt beneficioses:

• són derivats del pBR322,

• És menut, de modo que pot transportar fragments de ADN relativament grans (d'uns 10 000 pares de bases).

• Té un orige de replicació i pot produir fins a 500 còpies dels fragments de ADN insertat per cèlula.

• S'ha modificat per a que presente moltes seqüències de reconeiximent per a enzimes de restricció que s'han agrupat en una regió denominada polylinker o multiple cloning site.

• Permet l'identificació senzilla dels plásmidos recombinantes, ya que conté un fragment del gen bacterià lacZ que produïx colónies de color blau, al desdoblar i precipitar el reactiu X-Gal, per mig de l'enzima Beta-galactosidasa codificada per lacZ. Si s'inserta un fragment de ADN en el polylinker, s'inactiva este gen, l'enzima Beta galactosidasa no es produïx i per tant el X-gal no es precipita i açò dona lloc a colónies de color blanc.

Bacteriòfec lambda

Artícul principal → Fago λ.

El genoma del fago lambda s'ha cartografiat i secuenciado completament. Per a ser utilisat de vector, el terç central del seu cromosoma pot ser reemplaçat per ADN exógeno, sense que això afecte a la capacitat del fago d'infectar cèlules i formar cápsides.

Per a clonar ADN utilisant este vector, es purifica el ADN del fago i es talla en una enzima de restricció, en la mateixa enzima de restricció tallem el fragment de ADN d'interés i els unim en una ADN ligasa. Els vectores lambda recombinantes s'empaqueten in vitro en les cápsides proteiques del fago, i s'introduïxen en cèlules hoste bacterianes. Dins de les bactèries, els vectores es repliquen i formen moltes còpies del fago infectivo, duent totes elles el fragment de ADN d'interés en la clonació. Els vectores fágicos poden transportar fragments de fins a 20 kb ( kilobases).

Cósmidos

Artícul principal → Cósmido.

Els cósmidos són vectores híbrits utilisant parts del cromosoma de lambda i de plásmidos. Tenen la seqüència cos del fago lambda, necessària per al empaquetamiento de el ADN del fago dins de la seua coberta proteica, ademés contenen seqüències plasmídicas necessàries per a la replicació i gens de resistència a antibiòtics. Els cósmidos poden transportar casi 50 kb de ADN insertat.

YAC

Artícul principal → Cromosoma artificial de rent.

Els YAC són cromosomes artificials de rent. Un YAC té telómeros en els seus extrems, un orige de replicació i un centrómero. Estos components estan units a gens marcadors de selecció i a un grup d'enzimes de restricció per a insertar ADN exógeno.

Estos cromosomes artificials de rent permeten clonar grans trossos de ADN, de 100 a 1000 kb.

BAC

Artícul principal → Cromosoma artificial bacterià.

Un BAC és un cromosoma artificial bacterià, basat en el plásmido de fertilitat ( factor F ) de bactèries. És el més utilisat.

El factor F és un plásmido que es replica independentment i que transferix informació genètica durant la conjugació bacteriana.

Els BAC són circulares i molt estables, en lo que no es trenquen. Tenen un tamany de 100 kb i poden transportar insertos d'entre 100 i 300 kb. Solament permeten una còpia del cromosoma per cèlula.

Fagémidos

Artícul principal → Fagemido.