Cromosoma artificial de rent

El cromosoma artificial de rent o YAC (Yeast artificial chromosome) forma part dels vectores de clonació d'alta capacitat sent, de fet, el de major capacitat (200 kb - 3.000 kb). Varen ser descrits per primera volta en 1983 per Murray i Szostack.

És un vector que pretén imitar les característiques d'un cromosoma normal d'una rent (eucariota), portant un centrómero i telómeros terminals. Açò permet clonar en rent (microorganismes eucariotas) seqüències de ADN de fins a un milló de parells de bases o més, en comportar-se com un cromosoma propi del rent.

Són utilisats en construcció de genotecas genómicas, sent molt estés el seu us en els primers anys del Proyecte Genoma Humà. No obstant, són més inestables que atres vectores com BACs (cromosoma artificial bacterià), que han acabat imponent-se.

Els YAC tenen un orige de replicació relaixat en procariota, per lo que apareixen moltes còpies en cada bactèria (gran utilitat per a produir massivament el vector), pero un orige de replicació estricte en rent, apareixent només una còpia per cèlula de rent.

Un YAC típic té:

• ARS1: seqüència de replicació autònoma
• CEN4: centrómero del cromosoma IV, permet la segregació del plásmido durant la divisió celular
• TELs: seqüències teloméricas.
• HIS3, TRP1, URA3: marcadors de selecció en rent conferixen prototrofía para histidina, triptófano i uracilo
• SUP4: canvia la mutació sense sentit àmbar (UAG) per l'incorporació de tirosina. Identifica les cèlules que incorporen el vector, ya que les cèlules hoste que porten esta mutació àmbar, de color rosat, passen a tindre un fenotip blanc. (Prototrofo para ade).

Procediment de clonació

a) Digestió en BamHI i EcoRI. Desfosforilación dels extrems 5’. Açò linealiza el vector, deixant funcionals les seqüències teloméricas. S'eliminen els marcadors His3 i Sup4. b) Digestió de la nostra mostra en EcoRI. Selecció dels fragments per electroforesis i purificació. c) Reacció de ligación: Dona una molècula en un centrómero i telómeros terminals. d) S'induïx la seua entrada en cèlules per electroporación. Es clonen en gran cantitat en bactèries. Després s'extrauen i purifiquen i s'introduïxen en rent per electroporación. i) Se seleccionen els rent que porten el vector per mig de cultiu en un mig de cultiu sense Trp, sense Ura, en His i en Adenina. Les colónies capaces de créixer en este mig i que tinguen coloració rosada (trencament de el SUP4 com a conseqüència de l'entrada de l'inserte), seran les que tinguen els clons que nos interessen. f) El vector es comporta com un cromosoma més del rent.