Cultiu celular
El cultiu celular és el procés per mig del que cèlules, ya siguen cèlules procariota o eucariota, poden cultivar-se en condicions controlades. En la pràctica el terme "cultiu celular" s'usa normalment en referència al cultiu de cèlules aïllades d'eucariota pluricelularés, especialment cèlules animals. El desenroll històric i metodològic del cultiu celular està íntimament lligat als péptidos cultivares del cultiu de teixits i el cultiu d'òrguens.
El cultiu de cèlules animals va escomençar a ser una tècnica rutinària de laboratori durant els anys 50,[1] pero el concepte de mantindre llínees de cèlules vives separades del teixit d'orige va ser descobert en el XIX.[2]
Història
[editar | editar còdic]El fisiólogo anglés Sydney Ringer va desenrollar en la década de 1880 una solució salina, coneguda com solució de Ringer, que conté clorur de sodi, potassi, calcio i magnesi, dita solució és capaç de mantindre clapint el cor d'un animal fora del cos.[3] En 1885 Wilhelm Roux va extraure una porció de la mèdula d'embrió de pollet i la va mantindre varis dies en cultiu en una solució salina tébea, establint el principi dels cultius tisulares. Ross Granville Harrison, treballant en l'Escola de Medicina de l'Universitat Johns Hopkins i més vesprada en l'Universitat de Yale, va establir la metodologia del cultiu tisular en una série de treballs publicats entre 1908 i 1910.
Les tècniques de cultiu celular varen alvançar significativament en els 40 i 50, com a soport a l'investigació en virología. L'utilisació de cultius celulars per a produir virus va permetre preparar virus purificats per a ser utilisats en vacunas. La vacuna Salk de la polio va ser un dels primers productes produïts en massa usant tècniques de cultius celulars. Esta vacuna va ser possible gràcies a l'investigació de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller i Frederick Chapman Robbins, els qui varen ser guardonats en el Premi Nobel pel descobriment d'un método de creiximent de virus en cultius celulars de renyó de mona
Conceptes en el cultiu de cèlules de mamífer
[editar | editar còdic]Aïllament de cèlules
[editar | editar còdic]Les cèlulas poden ser aïllades dels teixits per a cultius in vitro de moltes maneres. Les cèlules poden ser purificades en facilitat de la sanc, no obstant solament els leucocits són capaços de créixer en cultiu. Les cèlules mononucleares es poden lliberar dels teixits blans per mig d'hidrólisis enzimàtica en enzimes com la colagenasa, tripsina o pronasa, que degraden la matriu extracelular. Com a alternativa es poden colocar trossos de teixit en mig de creiximent, i les cèlules que creixen són aptes per al cultiu. Este método és el conegut com cultiu de explantos.
Les cèlules que es cultiven directament des d'un subjecte es coneixen com a cèlules primàries. A excepció d'alguns derivats de tumorés, la majoria dels cultius celulars primaris tenen un periodo de vida llimitat. Despuix d'un cert número de divisions les cèlules entren en el procés de senescencia i deixen de dividir-se, generalment mantenint la viabilitat.
Manteniment de cèlules en cultiu
[editar | editar còdic]Les cèlules es cultiven i mantenen a una apropiada temperatura i mescla de gasés (habitualment, 37°C, 5% CO2 i 95% O2) en un incubador celular. Les condicions de cultiu varien àmpliament per a cada tipo celular, i la variació de les condicions per a un tipo celular concret, pot donar lloc a l'expressió de diferents fenotips.
Ademés de la temperatura i la mescla de gasos, el factor més comunament variat en els sistemes de cultiu és el mig de creiximent per a cultiu celular. Les receptes per als mijos de creiximent poden variar en pH, concentració de glucosa, factors de creiximent i la presència d'atres components nutritius. Els factors de creiximent usats per a suplementar als mijos deriven a sovint de sanc animal, com el sèrum vacú. Estos ingredients derivats de la sanc plantegen una potencial contaminació en virus o prionés dels productes farmacèutics derivats. En l'actualitat es tendix a minimisar o eliminar l'us d'estos ingredients quan siga possible. Estratègies alternatives d'abastiment involucren la sanc dels animals procedents de països en un risc mínim d'encefalopatia espongiforme vacuna, com Austràlia i Nova Zelanda, i l'us de nutrients purificada concentrats derivats de sèrum en lloc de sèrum animal sancer per al cultiu de cèlules.[4]
Les cèlules poden créixer en suspensió o de manera adherente. Algunes cèlules viuen de forma natural sense adherir-se a una superfície, com les que existixen en el torrent sanguíneu. Unes atres necessiten una superfície, com la majoria de cèlules derivades de teixits sòlits. A les cèlules que creixen sense unir-se a una superfície li les crida cultius en suspensió. Alguns cultius celulars adherentes poden créixer en plàstic per al cultiu de teixits, que pot estar recobert en components de la matriu extracelular per a aumentar les seues propietats d'adheriment i proporcionar atres senyals necessàries per al creiximent i diferenciació. Un atre tipo de cultiu adherente és el cultiu organotípico que consistix en cultivar les cèlules en un ambient tridimensional a diferència de les plaques de cultiu bidimensionales. Este tipo de cultiu 3D és bioquímica i fisiológicamente similar al teixit viu. No obstant presenta dificultats tècniques per varis factors (per eixemple: difusió).
Manipulació de les cèlules en cultiu
[editar | editar còdic]En estar generalment les cèlules en contínua divisió durant el cultiu, és normal que creixquen fins a ocupar tota l'àrea o volum disponible. Açò pot generar varis problemes:
- Agotament dels nutrients del mig
- Acumulació de cèlules apoptóticas o necróticas
- Inhibició de la divisió celular per contacte: els contactes entre cèlules poden desencadenar un arrest del cicle celular
- Diferenciació celular promiscua provocada pels contactes intercelulares
Estos problemes poden afrontar-se per mig de métodos de cultiu celular en esterilidad. L'objectiu d'estos métodos és evitar la contaminació en bactèrias o rents que competirien pels nutrients i/o podrien infectar i aixina eliminar les cèlules. Tota manipulació es porta a terme, típicament, en una campana de fluix laminar per a evitar l'entrada de microorganismes contaminants. També poden afegir-se antibiòtics al mig de cultiu.
Entre les manipulacions més comunes portades a terme en cultius celulars, es troben els canvis de mig, el passe de les cèlules i la transfección.
Canvis de mig
[editar | editar còdic]L'objectiu dels canvis de mig és renovar els nutrients i evitar l'acumulació de productes metabòlics potencialment tòxics i de cèlules mortes. En el cas de les suspensions celulars, les cèlules se separen del mig per mig de centrifugación i es resuspenden en mija fresca. En els cultius adherentes, el mig pot eliminar-se directament per mig d'aspiració i reemplaçar-se per la fresca.
Passe de les cèlules
[editar | editar còdic]El passe de les cèlules supon transferir un menut número de cèlules a un nou continent. Les cèlules poden cultivar-se més temps si es passen regularment, ya que aixina s'evita la senescencia associada a situacions prolongades d'alta densitat celular. En cultius en suspensió el passe es fa fàcilment, prenent una menuda cantitat de cultiu que continga unes poques cèlules i diluint-la en un volum major de mija fresca. En cultius adherentes, les cèlules han de ser inicialment desapegades; açò s'efectua comunament en una mescla de tripsina i EDTA, encara que actualment existixen atres mescles d'enzimes per a açò. Un menut número de les cèlules desapegades poden sembrar-se en un nou continent.
Transfección i transducción
[editar | editar còdic]- Artícul principal → Transfección.
Un atre método comú en la manipulació de les cèlules és l'introducció d'un DNA extern per transfección. Açò es porta a terme a sovint per a conseguir que les cèlules expressen una proteïna d'interés. Més recentment, la transfección de RNA interferentes s'han portat a terme com a mecanismes adequats per a suprimir l'expressió d'un particular gen.
El DNA també pot ser introduït en les cèlules usant virus, en métodos cridats transducción, infecció o transformació. Els virus, com a agents paràsits, són adequats per a introduir DNA en cèlules, ya que açò forma part del seu cicle normal de reproducció.
Llínees celulars humanes establides
[editar | editar còdic]
Les llínees celulars originades a partir de teixit de sers humans presenten controvèrsia bioéticas, ya que poden sobreviure als organismes parentals i ser utilisades per al descobriment de tractaments mèdics molt lucratius despuix del decés de les persones que les varen produir. Una decisió pionera en este aspecte va ser el fallo de la Suprema Cort de Califòrnia que en 1990 va determinar que els pacients no tenen drets propietaris sobre les llínees celulars derivades d'òrguens retirats en el seu consentiment.[5] S'estima que aproximadament el 20% de les llínees celulars humanes no corresponen al tipo de cèlules que generalment s'assumix que són.[6] Açò es deu a que algunes llínees celulars creixen més ràpit que unes atres i poden contaminar cultius d'atres llínees celulars i, en el temps, sobrecrecer i desplaçar a les cèlules originals. El contaminant més comú és la llínea celular HeLa. Este fet no és significatiu quan s'estudien les propietats generals del metabolisme celular pero és molt important en l'investigació mèdica enfocada en un tipo específic de cèlules. Els resultats de tals investigacions contindran errors, si no estan completament equivocats en les seues conclusions, en possibles conseqüències per als desenrolls terapèutics basats en ells.[7][8]
Generació de hibridoma
[editar | editar còdic]- Artícul principal → Hibridoma.
És possible fusionar cèlules normals en una llínea celular immortalisada. En este método es produïx anticossos monoclonales. Breument, els limfocit aïllats del bazo o mèdula òssea d'una rata inmunizado es combinen en una llínea celular de mieloma immortalisada (cèlules del linaje B) per a produir un hibridoma el qual posseïx la especificidad d'anticossos dels limfocit primaris i l'immortalitat de la llínea celular de mieloma. Les cèlules de mieloma sense fusionar se seleccionen en un mig de cultiu selectiu (HA o HAT), d'esta manera els limfocits primaris moren ràpidament i solament les cèlules fusionades sobreviuen. Els hibridoma productors de l'anticòs desijat se seleccionen a partir de grups fins a aplegar a colónies individuals.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Arshad Chaudry. «Cell Culture» (en anglés). The Science Creative Quarterly. Consultat el 8 de març de 2010.
- ↑ Bruce Alberts et al.. «Some Landmarks in the Development of Tissue and Cell Culture» (en anglés). Molecular Biology of the Cell. Consultat el 8 de març de 2010.
- ↑ (en anglés) Ringer S., An Experimental Investigation to ascertain the Action of Veratria on a Cardiac Contraction, J. Physiol. 1886; 6; 150-292. Pot accedir-se online a este artícul [1] archivat en Wayback Machine. en format pdf.
- ↑ «LipiMAX purified lipoprotein solution from bovine serum» (en anglés). Selborne Biological Services. Archivat des d'el original, el 8 de juny de 2012. Consultat el 8 de març de 2010.
- ↑ «Moore v. Regents of University of Califòrnia (1990) 51 C3d 120» (en anglés). ceb. Consultat el 8 de març de 2010.
- ↑ (MacLeoud et al. 1999)
- ↑ Nature reviews. Cancer.2(4)
- 315–9.ISSN 1474-175X.doi:10.1038/nrc775.
- ↑ (Masters 2002). Vore List of contaminated cell lines.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Cultivo celular» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.