Anar al contingut

SiRNA

De L'Enciclopèdia, la wikipedia en valencià
Artícul principal → RNAi.

Plantilla:Títul minúscula siRNA són les sigles en anglés de small interfering RNA, en espanyol ARN menut d'interferència (ARNpi) o ARN de silenciamiento, una classe d'ARN bicatenario.

És un tipo d'ARN interferente en una llongitut de 20 a 25 nucleòtits que és altament específic per a la seqüència de nucleòtits del seu ARN mensager diana, interferint per això en l'expressió del gen respectiu. Intervé en el mecanisme denominat interferència de ARN (RNA interference, RNAi), a on el siRNA interferix en l'expressió d'un gen específic, reduint-la. Ademés, els siRNAs també actuen en atres rutes relacionades en el RNAi, com en la defensa antiviral o en l'organisació de l'estructura de la cromatina en un genoma. La complexitat d'estes rutes és l'objecte d'intensos estudis, i el seu descobriment va ser la raó per la qual Craig C. Mello i Andrew Fire varen rebre el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina 2006.

Archiu:Caps block 17 .jpg
Proteïna DICER de Giardia intestinalis.

Definició i modo de funcionament

[editar | editar còdic]

Els siRNAs són molècules de ARN doble bri de 20-25 nucleòtits (nt) perfectament complementàries, que s'originen a partir d'un ARN llarc de doble bri (dsRNA, double strand RNA). Els dsRNAs poden ser d'orige endógeno (per eixemple els tránscritos generats a partir de seqüències de ADN repetides en tàndem), o d'orige exógeno (com a virus o transgenes). L'enzima responsable del processament del dsRNA en molècules de siRNAs és Dicer, una enzima citoplásmica de la família ARNasa III, que processa el dsRNA en fragments de ARN doble bri en extrems 5' fosfat i 2 nucleòtits lliures en extrem hidroxilo (-OH) en 3'.[1]

Els siRNAs suprimixen l'expressió dels gens diana per mig del tall de el ARN mensager (ARNm) complementari en dos mitats, a través de l'interacció del bri antisentido del siRNA en el complex RISC (RNA-induced silencing complex). Les dos mitats de el ARNm són posteriorment degradades per la maquinària celular, lo que comporta la supressió de l'expressió del gen.[2]

Per un atre costat, els siRNAs promouen la modificació de el ADN, facilitant el silenciamiento de la cromatina, ya que favorixen l'expansió dels segments de heterocromatina, a través del complex RITS (RNA-induced transcriptional silencing).[3]

Descobriment

[editar | editar còdic]

PTGS en plantes

[editar | editar còdic]
Archiu:Rnai phenotype petunia crop.png
Eixemple de plantes de petunia en les que els gens responsables de la pigmentació han segut silenciats per mig de RNAi. La planta de l'esquerra és de tipo salvage (no modificada); les de la dreta expressen un transgén (gen introduït artificialment) que induïx la supressió de l'expressió del transgén i el gen endógeno, produint àrees blanques no pigmentadas en la flor.[4]

El mecanisme d'interferència de ARN (RNAi) es va observar per primera volta en plantes com a part del silenciamiento post-transcripcional de gens (PTGS). Investigadors que tractaven d'introduir transgenes en petunias per a conseguir flors d'un color violeta més intens, varen obtindre flors en zones blanques, lo que indicava que tant els transgenes introduïts com els gens endógenos havien segut silenciats.[5] Este efecte es va denominar co-supressió, i es va observar que podia induir-se per:

  • l'expressió d'un transgén en alts nivells
  • transgenes que s'expressen en nivells menors, pero que s'integren en el genoma de la planta en còpies múltiples
  • per seqüències homòlogues a un gen endógeno que s'han introduït per mig d'un virus

Per esta raó, es va supondre que este era un mecanisme de defensa en les plantes, de manera que estes responen a l'infecció dels retrovirus per mig de la destrucció dels ARN virals. No obstant, el mecanisme d'acció era desconegut.

La tecnologia anti-sense en cucs

[editar | editar còdic]
Archiu:Celegans wt nhr80rnai.png
Un cuc adult C. elegans, que ha creixcut baix supressió per mig de RNAi d'un receptor hormonal nuclear implicat en la regulació de l'enzima desaturasa. Estos cucs tenen un metabolisme d'àcit grassos anormal, pero són viables i fèrtils.[6]

Per un atre costat, els investigadors que treballaven en la década dels 90 en el cuc C. elegans, injectaven ARN-antisense en les gònades del cuc per a tractar d'interferir en l'expressió dels gens, ya que pensaven que el ARN-antisense es aparearía en el ARNm (sense), evitant d'esta forma la traducció de el ARNm i suprimint l'expressió del gen objectiu. No obstant, Guo i Kemphues,[7] varen observar que l'injecció de ARN-sense en el cuc era igualment eficaç que el ARN-antisense per a la supressió de l'expressió gènica. Pero no podien explicar per qué raó.

En 1998, Andrew Fire, Craig C. Mello i colaboradors varen publicar un treball en Nature,[8] en el qual indicaven que, si injectaven solament ARN de bri simple en el cuc, tant sense com antisense, no s'observava cap efecte. No obstant, si injectaven ARN doble bri (dsRNA), observaven la supressió específica del gen objectiu. Açò pot semblar contradictori en els resultats de Guo i Kemphues,[7] pero estos varen injectar ARN de bri simple (sense o antisense) que no havia segut purificat, de manera que en el procés de producció es produïxen segments de doble bri, que són els que generen la supressió observada per Guo i Kemphues. No obstant, Fire i Mello varen utilisar ARN purificat, que no conté dsRNA i per tant és inactiu. Quan els bri sense i antisense es aparean per a produir dsRNA, l'efecte de supressió és 100 voltes major a l'observat en els bri simples per separat.

Aixina mateix, en el mateix reporte, Fire i Mello varen establir que l'interferència de l'expressió del gen objectiu es produïx a nivell de el ARNm: quan varen injectar en cucs dsRNA contra el gen mex-3, varen detectar que el ARNm de mex-3 desapareix, i per tant els cucs no són viables. No obstant, quan injectaven ARN de bri simple (sense o antisense) contra mex-3, la major part de el ARNm de mex-3 permaneixia intacte, i per això no s'observa fenotip.[8]

Igualment, també varen establir que l'efecte de supressió solament ocorre si el dsRNA que s'introduïx en el cuc és complementària d'una regió codificante (exones), pero no si és complementària d'una regió no codificante (intrones o el promotor). Açò indica que l'interferència es produïx a nivell del ARNm, quan ya s'han eliminat els intrones del pre-ARNm, i per tant és un mecanisme post-transcripcional.[8]


Inicialment els dsRNAs s'injectaven en les gònades dels cucs, pero també poden ser injectats en l'intestí o en el cap. Inclús s'observa efecte quan els cucs són alimentats en ceps de E. coli portadores d'un plásmido a partir del com es transcribe el dsRNA. En este cas l'efecte és una miqueta més dèbil, pero encara evident. En tots els casos l'efecte sobre l'expressió del gen diana s'observa no solament en el teixit injectat, sino en la majoria dels teixits, lo que indica que la senyal pot transmetre's d'una cèlula a una atra.

Prova de l'existència dels siRNAs

[editar | editar còdic]

Una volta que va estar clar que el mecanisme de RNAi actua directament sobre el ARNm, permaneixia una important qüestió: ¿qué és lo que causava la degradació de el ARNm? Els experiments descrits a continuació expliquen cóm es varen descobrir els siRNAs.

Per a explicar la co-supressió observada en plantes, es va propondre l'existència de ARNs anti-sense, que per mig de apareament de bases en el ARNm diana, d'alguna manera promourien la degradació de el ARNm o interferirien en la traducció del mateix. No obstant, en les cèlules afectades no es varen detectar ARNs anti-sense que tingueren el tamany dels ARNm, de manera que els investigadors varen analisar si en les plantes transgèniques afectades apareixien molècules de ARN de menor tamany.

En un d'estos experiments, realisat per Hamilton i Baulcombe[9] en 1999, es va analisar la presència de menuts ARNs en cinc llínees de plantes de tomata, que havien segut transformades en un plásmido que codificava per a ACO (aminocyclopropane-carboxylate oxidase). En dos de les llínees analisades l'expressió de el ARNm de ACO havia segut suprimida, i conseqüentment el ARNm no es detectava en Northern blots.[10] Per a detectar la possible presència de ARN menuts es varen utilisar geles de Northern blot en major concentració de poliacrilamida, utilisant com sonda tránscritos sense o anti-sense. Només en les plantes en les que l'expressió de ACO havia segut suprimida es varen detectar ARNs d'aproximadament 25 nt en abdós sondes, pero no es varen detectar en les plantes en les que el ARNm de ACO estava encara present. Per tant, es va demostrar la presència dels menuts ARN proposts, en plantes en les que l'expressió de ACO estava afectada. En experiments similars es va demostrar que plantes infectades en virus també contenen menuts ARNs en seqüències virals.

És important notar que estos menuts ARNs no són productes de la degradació de el ARNm, perque es varen trobar no només molècules sense, sino també anti-sense.


Archiu:Drosophila melanogaster - side (aka).jpg
Un eixemplar adult de la mosca Drosophila, un organisme modele utilisat freqüentment en experiments de RNAi.

Per a estudiar en més profunditat el mecanisme de RNAi, es varen utilisar sistemes in vitro. En 2000, Phil Zamore, Tom Tuschl i colaboradors[11] varen desenrollar un sistema in vitro per a estudiar embrions de Drosophila. El grup de Greg Hannon[12] va desenrollar un atre sistema in vitro, utilisant extractes de cèlules de Drosophila en cultiu.

Zamore, Tuschl i colaboradors varen ser els primers en mostrar que el ARNm incubado en un extracte es degrada en presència de dsRNA. Per a això, varen afegir a l'extracte dos ARNm model que codifiquen per a proteïnes luciferasa de 2 espècies diferents (Drosophila no codifica la proteïna luciferasa). Quan es va afegir a l'extracte dsRNA contra el ARNm de luciferasa, el ARNm va ser degradat eficientemente. Quan es va afegir ARN antisense, només es va degradar una menuda cantitat de el ARNm, i l'adició de tampó únicament (control negatiu) no va produir cap efecte.[11] Estos resultats són similars als obtinguts en els experiments in viu en C.elegans, a on es va demostrar que els dsRNAs són molt més eficients que el ARN antisense en la producció d'un efecte de RNAi.[8]

En un atre experiment, Zamore, Tuschl i colaboradors[11] varen comprovar si els dsRNAs són processats en menuts fragments de 25 nt (com ocorre en plantes). En este experiment, dsRNAs marcats radiactivamente be en el bri sense, en la antisense o en les dos, es incubaron en els extractes de Drosophila en presència o absència de ARNm. Quan els dsRNA es incubaron en l'extracte, varen aparéixer fragments de 21 a 23 nts, independentment de la presència de ARNm, indicant que els menuts ARNs procedixen del dsRNA i no de el ARNm. Este experiment mostrava ademés que abdós bri del dsRNA (la sense i la antisense) es tallen en menuts fragments, perque els fragments apareixen tant quan els dsRNAs han segut marcats solament en el bri sense, com quan has segut marcats només en la antisense. Este experiment mostra que els dsRNAs incubados en l'extracte són processats en menuts fragments de 21-22 nts. Este resultat és similar al resultat en plantes[9] mencionat anteriorment.

Per tant, la conclusió dels estudis precedents és que fragments de dsRNA (introduïts en les plantes o afegitons als extractes) són degradats en fragments de 21-25 nts, que són capaços de reconéixer el ARNm diana present en la planta o en l'extracte, induint a la seua volta la degradació d'este.

Els components del mecanisme de RNAi

[editar | editar còdic]
Archiu:Caps block 188 Ai-simplified.png
L'enzima Dicer curta ARN doble bri i genera siRNAs o miRNAs. Estos ARN menuts s'incorporen en el complex RISC (RNA-induced silencing complex), dirigint-ho contra l'ARNm complementari, i be ho talla (siRNAs), be inhibix la seua traducció (miRNAs).[12]

Estudis posteriors varen permetre elucidar en més detall el mecanisme de RNAi.[13] Quan s'introduïxen en un organisme (per eixemple, en plantes despuix de l'infecció en un virus de ARN, o simplement injectant dsRNA en plantes o nemátodos), el ARN exógeno és reconegut per la cèlula i unit a una enzima anomenada Dicer, que conté diferents dominis. Dicer talla el dsRNA en fragments d'al voltant de 22 nts. Estos menuts dsRNAs (siRNAs) s'incorporen en un complex en múltiples components, denominat RISC (RNA-induced silencing complex). El complex RISC té que ser activat (RISC*) a partir d'una forma latent, per mig del desapareamiento dels dos bri dels siRNAs. RISC* utilisa el bri antisentido del siRNA com a guia per a seleccionar el seu substrat: el ARNm complementari del bri de siRNA present en el complex. A continuació, RISC* promou el tall i posterior destrucció de el ARNm diana, provocant la supressió de l'expressió del gen (en l'image de la dreta, el mecanisme que utilisen els siRNAs correspon a la part central i esquerra).

Identificació de Dicer

[editar | editar còdic]
Artícul principal → Dicer.

La següent qüestió que necessitava resoldre's era identificar l'enzima ribonucleasa (ARNasa) involucrada en la fragmentació dels dsRNAs. ya que s'havien purificat prèviament els fragments de la degradació (els siRNAs), se sabia que l'enzima tenia que ser capaç de produir fragments en grups 5' fosfat i 3' hidroxilo, la qual cosa reduïa el número de candidats: en concret, les ARNasas de la família de la ARNasa III fragmenten dsRNAs d'esta forma. Es coneixien tres tipos de ARNasa III:

  • ARNasa III canònica (E. coli): 1 motiu ARNasaIII i 1 dsRBD (en anglés, double strand RNA binding domain)
  • Drosha: 2 motius ARNasa III i 1 dsRBD
  • Dicer: 2 motius ARNTorra III, 1 domini helicasa i 1 dsRBD

Per a provar quin d'estes ARNasas podia degradar dsRNA en fragments de 22 nt, en 2001 Bernstein i colaboradors[1] varen expressar en cèlules S2 de Drosophila totes les proteïnes candidates com a proteïnes marcades en una etiqueta (com GST, glutathione S-transferase). Les proteïnes varen ser purificades en un anticòs dirigit contra l'etiqueta i incubadas en un dsRNA dirigit contra ciclina E. El resultat d'este experiment va mostrar que solament Dicer és capaç de tallar el dsRNA llarc en fragments menuts. Les atres ARNasas no varen fragmentar el dsRNA. Com a control negatiu es va utilisar la proteïna "homeless", per a provar si el domini helicasa de Dicer podria estar implicat en la reacció. Ademés l'experiment va provar que la reacció precisa ATP.


Per a poder unir-se a les molècules de dsRNA, Dicer necessita formar un complex en atres proteïnes que l'assistixen en les seues funcions, com la proteïna R2D2 en Drosophila o RDE-4 i RDE-1 en C.elegans.[14]

El complex RISC

[editar | editar còdic]
Archiu:Argonaute 1u04 1ytu composite.png
Esquerra: Una proteïna Argonauta completa de l'espècie Pyrococcus furiosus de la família de les archaea. Dreta: El domini PIWI d'una proteïna Argonauta en complex en ARN doble bri.

Els siRNAs generats per Dicer es ensamblan en el complex RISC (sigles en anglés de RNA-induced silencing complex) que conté diferents factors celulars.[15][16]


El component actiu del complex RISC és una proteïna de la família de les endonucleasas denominades Argonautas, que tallen el bri de ARNm diana complementària al siRNA que està associat a RISC.[17] Com els fragments produïts per Dicer són de doble bri, en teoria abdós bri podrien produir un siRNA funcional. No obstant, solament una dels dos bri (l'antisense), denominada el bri guia, s'unix a la proteïna Argonauta i dirigix el procés de degradació de el ARNm complementari. L'atre bri (la sense), denominada bri passager, és degradada durant el procés d'activació de RISC.[18] Encara que en principi es va supondre que una helicasa depenent d'ATP separava abdós bri,[19] en realitat el procés és independent de ATP i realisat directament per proteïnes que componen el complex RISC.[20][21] El bri seleccionat com a guia tendix a ser aquella que el seu extrem 5' es aparea menys en la seua complementària,[22] encara que la selecció del bri guia no resulta afectada per la direcció en la que Dicer talla el dsRNA abans de la seua incorporació al complex

RISC.[23] No obstant, la proteïna R2D2 podria servir com el factor identificador, en unir-se a l'extrem 5' més estable del bri passager.[24]

Encara que existixen diferents proteïnes de la família Argonauta (Ago1, Ago2, Ago3 en mamífers), només Ago2 pot formar complexos RISC capaços de fragmentar el ARNm diana.[25] En el mateix estudi, es va demostrar aixina mateix que Ago2 és capaç de tallar el ARNm diana in vitro en presència d'un siRNA de bri simple, pero no d'un dsRNA, i que la reacció és independent de ATP. Aixina mateix, es varen identificar dos residus de Ago2 necessaris per a l'activitat enzimàtica: D597 i D669.

La base estructural per a l'unió de el ARN a la proteïna Ago2 ha segut examinada per mig de cristalografia de rajos X de l'unió del domini estructural d'una proteïna Argonauta unida a ARN. En este estudi, l'extrem 5' fosforilado del bri de ARN s'introduïx en un clavill de superfície bàsica conservada (present en proteïnes homòlogues de diferents espècies) i fa contacte a través d'un catión divalente (un àtom en dos càrregues positives) com el magnesi, i per apilamiento aromàtic (un procés que permet a més d'un àtom compartir un electró, passant-ho alvance i arrere) entre el nucleòtit 5' en el siRNA i un residu conservat de tirosina. Es pensa que este lloc forma un lloc de nucleación per a l'unió del siRNA al seu ARNm complementari.[26]


Encara no està clar cóm el complex RISC activat localisa els ARNm complementaris en l'interior celular. Encara que s'ha propost que el procés de fragmentació podria estar lligat a la traducció, la traducció de el ARNm diana no és essencial per a la degradació mediada per RNAi.[27] De fet, el procés de RNAi pot ser més efectiu contra ARNm dianes que no són traduïts.[28] Les proteïnes Argonauta, els components catalítics de RISC, estan localisades en regions específiques del citoplasma denominades P-bodies (cossos-P, també cossos citoplásmicos o cossos GW, perque contenen la proteïna GW182), els quals són regions en altes taxes de degradació de ARNm;[29] també s'ha detectat activitat miRNA en els P-bodies.[30] Alteració dels P-bodies disminuïx l'eficiència del procés de RNAi, lo que sugeria que els P-bodies podrien ser un lloc crític per al procés de RNAi.[31] No obstant, estudis posteriors han demostrat que els P-bodies no són imprescindibles per al procés de RNAi, ya que cèlules sense P-bodies poden produir silenciamiento tant en siRNAs com en miRNAs.[32]


Referències

[editar | editar còdic]
  1. ↑ 1,0 1,1 Nature.409(6818)
    363–366.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/35053110.Consultat el 2025-04-15.
  2. ↑ Nature Reviews. Molecular Cell Biology.8(1)
    23–36.ISSN 1471-0072.doi:10.1038/nrm2085.Consultat el 2025-04-15.
  3. ↑ Nature Structural & Molecular Biology.14(11)
    1041–1048.ISSN 1545-9985.doi:10.1038/nsmb1315.Consultat el 2025-04-15.
  4. ↑ PLoS biology.2(5)
    E133.ISSN 1545-7885.doi:10.1371/journal.pbio.0020133.Consultat el 2025-04-15.
  5. ↑ Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Gens in trans. Plant Cell. 1990 Apr;2(4):279-289 [1]
  6. ↑ Brock T, Browse J, Watts J(2006).2(7)
    i108.doi:10.1371/journal.pgen.0020108.Consultat el 22 de juliol de 2019.
  7. ↑ 7,0 7,1 Cell.81(4)
    611–620.ISSN 0092-8674.doi:10.1016/0092-8674(95)90082-9.Consultat el 2025-04-15.
  8. ↑ 8,0 8,1 8,2 8,3 Nature.391(6669)
    806–811.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/35888.Consultat el 2025-04-15.
  9. ↑ 9,0 9,1 Science (New York, N.Y.).286(5441)
    950–952.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.286.5441.950.Consultat el 2025-04-15.
  10. ↑ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.74(12)
    5350–5354.ISSN 0027-8424.doi:10.1073/pnas.74.12.5350.Consultat el 2025-04-15.
  11. ↑ 11,0 11,1 11,2 Cell.101(1)
    25–33.ISSN 0092-8674.doi:10.1016/S0092-8674(00)80620-0.Consultat el 2025-04-15.
  12. ↑ 12,0 12,1 Nature.404(6775)
    293–296.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/35005107.Consultat el 2025-04-15.
  13. ↑ Nature.418(6894)
    244–251.ISSN 0028-0836.doi:10.1038/418244a.Consultat el 2025-04-15.
  14. ↑ Current Opinion in Structural Biology.15(3)
    331–341.ISSN 0959-440X.doi:10.1016/j.sbi.2005.05.006.Consultat el 2025-04-15.
  15. ↑ Science (New York, N.Y.).293(5532)
    1146–1150.ISSN 0036-8075.doi:10.1126/science.1064023.Consultat el 2025-04-15.
  16. ↑ Gens & Development.16(19)
    2491–2496.ISSN 0890-9369.doi:10.1101/gad.1025202.Consultat el 2025-04-15.
  17. ↑ «Advanced Information: RNA interference». The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. Archivat des d'el original, el 25 de giner de 2007. Consultat el 25 de giner de 2007.
  18. ↑ Cell.123(4)
    631–640.ISSN 0092-8674.doi:10.1016/j.cell.2005.10.022.Consultat el 2025-04-15.
  19. ↑ (2004) Molecular Cell Biology, 5th ed. edició, WH Freeman: New York, NY. ISBN ISBN 978-0-7167-4366-8.
  20. ↑ Cell.123(4)
    607–620.ISSN 0092-8674.doi:10.1016/j.cell.2005.08.044.Consultat el 2025-04-15.
  21. ↑ EMBO reports.7(3)
    314–320.ISSN 1469-221X.doi:10.1038/sj.embor.7400637.Consultat el 2025-04-15.
  22. ↑ Cell.115(2)
    199–208.ISSN 0092-8674.doi:10.1016/s0092-8674(03)00759-1.Consultat el 2025-04-15.
  23. ↑ Current biology: CB.16(5)
    530–535.ISSN 0960-9822.doi:10.1016/j.cub.2006.01.061.Consultat el 2025-04-15.
  24. ↑ Science (New York, N.Y.).306(5700)
    1377–1380.ISSN 1095-9203.doi:10.1126/science.1102755.Consultat el 2025-04-15.
  25. ↑ Science (New York, N.Y.).305(5689)
    1437–1441.ISSN 1095-9203.doi:10.1126/science.1102513.Consultat el 2025-04-15.
  26. ↑ Nature.434(7033)
    666–670.ISSN 1476-4687.doi:10.1038/nature03514.Consultat el 2025-04-16.
  27. ↑ Differentiation; Research in Biological Diversity.73(6)
    287–293.ISSN 0301-4681.doi:10.1111/j.1432-0436.2005.00029.x.Consultat el 2025-04-16.
  28. ↑ RNA (New York, N.Y.).11(1)
    38–44.ISSN 1355-8382.doi:10.1261/rna.7158605.Consultat el 2025-04-16.
  29. ↑ Nature Cell Biology.7(6)
    633–636.ISSN 1465-7392.doi:10.1038/ncb1265.Consultat el 2025-04-16.
  30. ↑ Cell Cycle (Georgetown, Tex.).5(3)
    242–245.ISSN 1551-4005.doi:10.4161/cc.5.3.2410.Consultat el 2025-04-16.
  31. ↑ Nature Cell Biology.7(12)
    1267–1274.ISSN 1465-7392.doi:10.1038/ncb1334.Consultat el 2025-04-16.
  32. ↑ Molecular and Cellular Biology.27(11)
    3970–3981.ISSN 0270-7306.doi:10.1128/MCB.00128-07.Consultat el 2025-04-16.
Obtingut de «https://www.lenciclopedia.org/w/index.php?title=SiRNA&oldid=769220»