Cristalografia de rajos X

Cristalografia de rajos X

   

Processe de determinació de l'estructura d'una molècula per cristalografia de rajos X.

La cristalografia de rajos X és una tècnica experimental per a l'estudi i anàlisis de materials, basada en el fenomen de difracció dels rajos X per sòlits en estat cristalino.

Els rajos X són difractados pels electrons que rodegen els àtoms per ser el seu llongitut d'ona del mateix orde de magnitut que el radi atòmic. El fes de rajos X emergent despuix d'esta interacció conté informació sobre la posició i tipo d'àtoms trobats en el seu camí. Els cristals, gràcies a la seua estructura periòdica, dispersen elásticamente els fas de rajos X en certes direccions i els amplifiquen per interferència constructiva, originant un patró de difracció. Existixen varis tipos de detectors especials per a observar i medir l'intensitat i posició dels rajos X difractados, i el seu anàlisis posterior per mijos matemàtics permet obtindre una representació a escala atòmica dels àtoms i molècules del material estudiat.

Max von Laue va realisar els primers experiments de cristalografia de rajos X en 1912. Von Laue, William Henry Bragg i William Lawrence Bragg varen desenrollar inicialment la teoria de difracció de cristals, tasca a la que pronte es varen sumar atres científics. A lo llarc de el XX varen tindre lloc varis alvanços teòrics i tècnics, com l'aparició dels superordenadores i l'us de sincrotrones per a la producció de rajos X, que varen incrementar la capacitat del método per a determinar les propietats estructurals de tot tipo de molècules: sales, materials inorgànics complexos, proteïnas i fins a components celulars com els ribosomas. És possible treballar en monocristales o en pols microcristalino, conseguint-se diferents senyes en abdós casos: per a les aplicacions que requerixen solament una caracterisació precisa dels paràmetros de la ret cristalina, pot ser suficient la difracció de rajos X per pols; per a una dilucidación precisa de les posicions atòmiques és preferible treballar en monocristales.

Donada la relació existent entre l'estructura tridimensional de les molècules i les seues propietats químiques i físiques, la cristalografia ha contribuït a l'alvanç en vàries disciplines científiques com la química, la biologia molecular, la geologia, la física aplicada i la ciència de materials. L'àmplia disponibilitat de tubos de rajos X, complementada en el desenroll de fonts de rajos X d'alta intensitat ha aumentat significativament el seu impacte en estos camps d'investigació aixina com en àrees en aplicacions industrials, com el desenrolle de fàrmacs i la mineralogia aplicada. La major llimitació d'este método és la necessitat de treballar en sistemes cristalins, per lo que no és aplicable a dissolució, a sistemes biològics in viu, a sistemes amorfos o a gasés. En alguns casos, els rajos X poden trencar els enllaços químics que mantenen l'integritat estructural, lo que resulta en un model distorsionat de la molècula estudiada. Este problema afecta especialment als materials d'interés biològic.

Història

Primers experiments

L'idea de que els cristalés són una repetició periòdica d'un grup de molèculas ya existia anteriorment a que Wilhelm Conrad Röntgen descobrira els rajos X en 1895. Encara que les distàncies típiques entre els plans de la ret cristalina es desconeixien, se sabia que devien ser molt chicotetes comparades en la llongitut d'ona de la llum visible. Açò li va donar al físic alemà Max von Laue l'idea d'utilisar cristals de sulfat de coure per a determinar si els rajos X es componien de partícules o ones: va deduir que, si foren ones, deurien generar un patró de difracció en travessar els cristals. Els experiments es varen realisar en 1912, en l'ajuda de Walter Friedrich i Paul Knipping, abdós antics estudiants de Röntgen. Estos experiments varen confirmar la presència de difracció cristalina, interpretada per von Laue com l'extensió a tres dimensions de la difracció de Fraunhofer per un enreixat.

Poc despuix, els britànics William Henry Bragg i William Lawrence Bragg (pare i fill respectivament) varen reproduir l'experiment. W.L. Bragg va explicar la difracció com l'interferència dels rajos X reflectits per plans cristalins paralels, introduint la descripció coneguda des de llavors com la llei de Bragg. En 1913, Paul Ewald va demostrar que les dos interpretacions dels resultats publicades independentment per von Laue i Bragg eren equivalents. Von Laue va rebre el premi Nobel de Física en 1914 pel seu descobriment del fenomen, i els Bragg varen rebre el mateix premi un any més tart pel seu treball en les aplicacions pràctiques. Cap al final de la década, s'havia conseguit determinar les llongituts d'ona dels rajos X i l'estructura de varis composts inorgànics simples i s'havien establit les bases teòriques de la tècnica gràcies al treball dels ya mencionats investigadors, Charles Galton Darwin i Peter Debye, entre uns atres.

El desenroll de la tècnica: 1920-1960

El periodo entre 1920 i 1960 es va caracterisar per importants bestreta metodològiques que varen propiciar l'ocupació de la difracció de rajos X per a analisar estructures de molècules més complexes.

Durant la década de 1920, els alvanços de la teoria quàntica varen servir per a caracterisar més precisament l'interacció entre els rajos X i els àtoms dels cristals; açò va possibilitar l'anàlisis correcte de l'intensitat de la difracció. En la mateixa época varen aparéixer les taules per a determinar la simetria cristalina a partir de la distribució de reflexions en el patró de difracció i es varen escomençar a usar les séries de Fourier per a representar la distribució d'electrons en la ret cristalina. Els desenrolls en la representació matemàtica de la densitat electrònica varen continuar fins a la Segona Guerra Mundial, facilitant l'obtenció de les primeres estructures de molècules orgàniques. En 1935, el cristalógrafo britànic Arthur Patterson va descobrir un truc matemàtic per a obtindre les distàncies interatómicas directament a partir de les senyes experimentals, lo que va supondre un important alvanç en l'anàlisis de la difracció.

Entre les décades de 1940 i 1960, varen sorgir atres procediments per a la determinació d'estructures, especialment, métodos heurístics basats en el procés d'ensaig i error, que varen demostrar ser prou exactes en combinació en restriccions condicionants basades en les propietats físiques d'una estructura correcta, com per eixemple, que la densitat electrònica deu ser sempre positiva. En este periodo la cristalografia va escomençar a adquirir importància en el camp de la química orgànica, procés que va culminar en la determinació en 1957 de l'estructura de la vitamina B12, un proyecte liderat per Dorothy Hodgkin.

Alvanços en cristalografia d'macromolécula: 1960-1980

La bestreta més transcendent durant les décades dels 60 i 70 va ser el reconeiximent de la cristalografia de proteïnes i de molècules involucrades en processos biològics en general com a àrea d'investigació clau en la biologia molecular. L'any 1962 va marcar una fita en otorgar-se dos premis Nobel pels resultats obtinguts usant métodos cristalográficos en esta àrea: el premi Nobel de Química va ser concedit a Max Perutz i John Kendrew pels seus estudis cristalográficos de les proteïnes hemoglobina i mioglobina i el premie Nobel de Medicina a Francis Crick, James Watson i Maurice Wilkins per descobrir que l'ADN forma una doble hèliç. En 1964 Dorothy Hodgkin també va obtindre el premi Nobel de Química per la determinació de vàries estructures d'importància biològica, com la penicilina i la vitamina B12, entre unes atres.

Una bestreta que va facilitar en gran medida l'èxit de les tècniques cristalográficas tant en el cas d'macromolécula orgàniques en un gran número d'àtoms com en el de molècules de menor tamany va ser el desenroll d'ordenadors digitals; gràcies a ells va ser possible usar programes per a medir i analisar fàcilment les senyes obtingudes en els experiments en lloc de realisar els laboriosos càlculs manualment. No obstant, al final d'este periodo l'estudi de proteïnes estava encara llimitat per l'absència de fonts de rajos X intensos i l'ocupació de película fotogràfica per a medir els patrons de difracció, lo que requeria un llarc procés de revelat i digitalisació de les imàgens. A conseqüència d'estes llimitacions, i a pesar del reconeiximent generalisat del potencial de la cristalografia per a estos experiments, a finals de la década de 1970 el Banc de Senyes de Proteïnes solament contava en unes xixanta entrades.

Expansió i madurea: 1980-2010

Els tubo de rajos X, en successives millores, es varen utilisar com la font primordial de rajos X per als experiments de cristalografia des dels seus començos fins a la década de 1970, época en la que es va escomençar a experimentar en la radiació de sincrotrón de rajos X. Els sincrotrones dedicats exclusivament a la producció de rajos X varen aparéixer en la década de 1980 i el seu número no ha deixat d'aumentar des de llavors. En la primera década de el XXI es varen construir els primers làsers d'electrons lliures de rajos-X, capaços de produir fas de llum pulsada d'una intensitat d'órdens de magnitut major que en les fonts de llum sincrotrón convencionals. La duració dels polsos de llum, de l'orde de femtosegundos oferix la possibilitat d'observar canvis en els cristals a escales temporals inalcançables anteriorment. Durant estos anys també es varen desenrollar nous detectors bidimensionales o «d'àrea», capaces de generar directament una image digitalisada del patró de difracció. Estos detectors varen facilitar la ràpida medició i anàlisis de la difracció i varen substituir totalment a les plaques fotogràfiques usades fins a llavors.

Els mencionats alvanços, units a l'increment de la capacitat dels ordenadors moderns per a almagasenar i processar senyes, han permés portar a terme experiments antany irrealisables, i han desembocat en un aument exponencial del número d'estructures elucidadas per métodos cristalográficos. El desenroll més notable ha tingut lloc en l'àrea de les macromolécula orgàniques, en més de 88 000 estructures depositades en el Banc de Senyes de Proteïnes al començ de 2013. L'obtenció en 2000 de l'estructura del ribosoma, un enorme complex d'àcits nucleicos i vàries proteïnes a on té lloc la síntesis de proteïnes en la cèlula, ilustra les capacitats que ha alcançat la tècnica.

Aspectes físics

Cristals i rets cristalines

Estructura cristalina de [[clorur d'hidrogen]] deuterado en la cela unitat superposta sobre les molècules. La ret cristalina es forma per mig de la translació de la cela unitat a lo llarc de les direccions definides per $a,b$ i $c$.

Paràmetros de la cela unitat.

Artícul principal → Cela unitat.

Els cristals estan formats per una repetició periòdica de molècules en tres dimensions. El cristal es pot representar matemàticament com una ret tridimensional, cridada «ret de Bravais», en la que totes les interseccions, o nodos, són idèntiques. El paralelepípede definit per les llínees entre distints nodos de la ret es coneix com la cela unitat; encara que per a una ret donada siga possible designar múltiples celes unitat que complixquen esta definició, per convenció es tria habitualment la de menor volum que reflectixca la simetria del cristal. La cela unitat es definix per la llongitut dels seus costats $a$, $b$ i $c$ en la direcció dels tres eixos espacials i els ànguls $\alpha$, $\beta$ i $\gamma$ que els eixos de la ret formen entre sí. Les coordenades de qualsevol punt de la ret cristalina es poden expressar com una combinació llineal dels vectores $𝐚$, $𝐛$ i $𝐜$.

La posició d'un àtom en la cela unitat s'expressa com coordenades fraccionarias de $𝐚$, $𝐛$ i $𝐜$ de la següent forma:

$R=x𝐚+y𝐛+z𝐜$

en les coordenades ($x$, $y$, $z$) compreses entre 0 i 1.

L'objectiu dels experiments de difracció per rajos X és averiguar $x$, $y$ i $z$ per a cada àtom. Per a conseguir-ho és necessari, en primer lloc, determinar la relació entre la ret cristalina i la geometria del patró de difracció i, en segon lloc, obtindre les posicions dels àtoms a partir de l'intensitat de la difracció.

Rajos X

Artícul principal → Rajos X.

Representació esquemàtica d'una ona electromagnètica, mostrant l'oscilació periòdica dels camps elèctric i magnètic.

Els rajos X són un tipo de radiació electromagnètica en llongituts d'ona entre 10 i 10^-2 nm o energies entre 0,1 i 100 keV. Per als experiments de difracció cristalina se solen usar rajos X d'energia relativament alta, de l'orde de 10 keV, corresponent a llongituts d'ona de l'orde de 0,1 nm.

Els rajos X es descriuen matemàticament com una ona sinusoidal propagant-se a través de l'espai.

Prenent un punt arbitrari com a orige, el valor del camp elèctric $E$ en funció del temps $t$ es pot escriure com:

$E(t)=A\exp (2\pi ict/\lambda )$

$A$ és l'amplitut de l'oscilació, $\lambda$ la llongitut d'ona i $c$ la velocitat de la llum. A conseqüència de l'interacció en els electrons dels àtoms en la mostra, l'ona sofrix un desfasament $\alpha$ sobre l'ona en el punt d'orige:

$E(t)=A\exp (2\pi ict/\lambda )\exp (2\pi i\alpha )$

La diferència de fase depén de la distància entre el punt d'orige i els àtoms del material; açò implica que l'estructura atòmica, és dir, les posicions que ocupen els àtoms, es poden derivar de la fase dels rajos X que han travessat el material.

Dispersió elàstica de rajos X

Vore també: Factor de forma atòmica i factor d'estructura

El fenomen de difracció cristalina té el seu orige en la dispersió elàstica o scattering elàstic del fes de rajos X pels àtoms del cristal. En este tipo d'interacció, l'electró desvia els rajos X, que prenen exactament la mateixa trayectòria que un raig de llum visible reflectit en un espill, és dir, els rajos dispersats emergixen a un àngul $2\theta$ sobre la direcció dels rajos incidents. Tant l'electró com els rajos X conserven la seua energia inicial durant esta interacció.

La dispersió elàstica per un grup d'àtoms en una direcció donada es pot quantificar en una cantitat coneguda com factor d'estructura que és igual a la suma dels rajos reflectits per cada àtom $j$ que interactua en els rajos incidents

$𝐅(𝐒)=\sum _j{f}_j\exp (2\pi i{𝐫}_j\cdot 𝐒)$

$f$ és una funció anomenada factor de forma atòmica —o factor de dispersió atòmica— que descriu la dispersió per tots els electrons de l'àtom en conjunt. La dispersió elàstica atòmica depén del número atómico $Z$ i de l'àngul d'incidència dels rajos X. El canvi de fase dels rajos dispersats durant l'interacció ve dau pel producte escalar de ${𝐫}_j$, el vector entre l'orige i cada àtom $j$ i $𝐒$, conegut com a vector de dispersió, en magnitut $2\sin \theta /\lambda$ i direcció perpendicular al pla virtual de reflexió.

Difracció cristalina

Llei de Bragg

Artícul principal → Llei de Bragg.

La difracció en una direcció donada es deu essencialment a la relació entre les fases de totes les ones reflectides per cada cela unitat del cristal en eixa direcció. Els rajos que han travessat distints punts del cristal seguixen camins òptics de diferent llongitut i esta diferència dona lloc a un canvi en l'amplitut de l'ona resultant; quan la diferència de fase és de 180 graus, les ones s'anulen entre sí. Pel contrari, quan les ones estan en fase, l'amplitut de l'ona final és la suma de les amplitut per a cada ona. ya que un cristal està compost d'un gran número celes unitat, l'interferència constructiva entre totes elles resulta en un fes lo suficientment intens per a poder ser medit en un detector de rajos X.

Llei de Bragg: Els àtoms o grups d'àtoms en la ret cristalina estan representats per esferes (per a simplificar el diagrama, la tercera dimensió del cristal no es representa). Les esferes se situen sobre plans imaginaris paralels, perpendicular al diagrama, separats per $d$. Els rajos X incidixen sobre els plans a un àngul $\theta$. En l'image de l'esquerra, la diferència en el camí recorregut per les ones dispersades pels dos plans és un múltiple sancer de la llongitut d'ona; per lo tant, les ones emergents estan en fase i s'observa difracció a un àngul $\theta$ respecte dels plans de difracció o $2\theta$ respecte al fes incident. A la dreta, en un àngul d'incidència diferent, la Llei de Bragg no es complix per a esta família de plans cristalins; les ones emergents estan desfasadas i no s'observa difracció.

La condició per a que les ones estiguen en fase és que la diferència dels seus camins òptics siga zero o un múltiple sancer $n$ de la llongitut d'ona. En un cristal, la diferència en el camí òptic entre àtoms situats en posicions equivalents en distintes celes unitat és $2d\sin \theta$ a on $d$ és la distància entre els plans imaginaris que unixen els punts equivalents de la ret cristalina. És dir, per a que s'observe interferència constructiva de rajos X a un àngul d'observació $2\theta$, es deu complir l'expressió coneguda com a Llei de Bragg:

$n\lambda =2d\sin \theta$

Com en el cas de la dispersió elàstica per un àtom, la difracció cristalina es pot interpretar com la reflexió especular dels rajos X per tots els plans del cristal a un àngul $\theta$ del fes incident i separats entre sí per la distància $d$ que complix la llei de Bragg. Per este motiu, els punts del patró de difracció es denominen «reflexions».

Índexs de Miller: La figura mostra eixemples de diferents plans de difracció en una cela unitat, ilustrant la correspondència entre els índexs de Miller $hkl$ i l'orientació dels plans en el sistema de coordinades definit per aquella.

Índexs de Miller

Artícul principal → Índex de Miller.

Per a que es complixca la llei de Bragg per a un grup de plans de reflexió paralels, estos deuen creuar els eixos de la cela unitat un número entero de voltes. Les reflexions cristalines s'identifiquen per mig de tres números $h$, $k$ i $l$ iguals al número d'interseccions dels plans en els eixos $a$, $b$ i $c$ de la cela. Els números $h$, $k$ i $l$ reben el nom d'índexs de Miller. Matemàticament, els índexs de Miller descriuen un vector perpendicular al pla de reflexió en el sistema de coordenades definit per la ret cristalina.

La ret recíproca

Artícul principal → Ret recíproca.

Es denomina ret recíproca a la transformada de Fourier de la ret cristalina. Esta construcció matemàtica facilita la representació dels plans de reflexió i la visualisació de la relació entre l'orientació del cristal i el patró de difracció. Les coordenades de cada punt de la ret recíproca coincidixen en els índexs de Miller, és dir, cada punt de la ret recíproca representa a una família de plans de Miller en l'espai real de la ret cristalina; la distància de l'orige a cada punt de la ret és $1/d$.

De la mateixa manera que en el cas de la ret cristalina, els punts de la ret recíproca es poden expressar com una combinació llineal de vectores ${𝐚}^{\ast }$, ${𝐛}^{\ast }$ i ${𝐜}^{\ast }$:

$𝐎𝐇=h{𝐚}^{\ast }+k{𝐛}^{\ast }+l{𝐜}^{\ast }$

La relació entre els paràmetros de la cela unitat ($a$, $b$, $c$, $\alpha$, $\beta$, $\gamma$) de volum $V$ i la cela unitat recíproca ($a^{\ast }$, $b^{\ast }$, $c^{\ast }$, ${\alpha }^{\ast }$,${\beta }^{\ast }$, ${\gamma }^{\ast }$) és la següent:

$a^{\ast }=\frac{bc\sin \alpha }{V};b^{\ast }=\frac{ac\sin \beta }{V};c^{\ast }=\frac{ab\sin \gamma }{V}$

$V^{\ast }=a^{\ast }{b}^{\ast }{c}^{\ast }\sqrt{1-{\cos }^2{\alpha }^{\ast }-{\cos }^2{\beta }^{\ast }-{\cos }^2{\gamma }^{\ast }+2\cos {\alpha }^{\ast }\cos {\beta }^{\ast }\cos {\gamma }^{\ast }}$

$\cos {\alpha }^{\ast }=\frac{\cos \beta \cos \gamma -\cos \alpha }{\sin \beta \sin \gamma };\cos {\beta }^{\ast }=\frac{\cos \alpha \cos \gamma -\cos \beta }{\sin \alpha \sin \gamma };\cos {\gamma }^{\ast }=\frac{\cos \alpha \cos \beta -\cos \gamma }{\sin \alpha \sin \beta }$

Archiu:Ewald.gif

Representació bidimensional de la construcció de Ewald. Els rajos X incidents estan representats pel vector d'ona ${𝐊}_i$, d'amplitut $1/\lambda$. La ret recíproca es representa en blava; per a simplificar el diagrama, solament es mostren les coordenades d'alguns punts de la ret, representant als plans de Miller corresponents. El punt (4,1) coincidix en la superfície de l'esfera, per lo tant s'observarà un fes de rajos X en el vector d'ona ${𝐊}_f$ reflectit en la direcció donada per $2\theta$. La magnitut del vector diferencia entre ${𝐊}_i$ i ${𝐊}_f$ o vector de difracció és la distància entre els plans paralels d'índexs (4,1).

L'esfera de Ewald

Artícul principal → Esfera de Ewald.

Per a visualisar fàcilment els plans de Miller que contribuïxen a la difracció en una direcció donada i determinar la relació entre l'orientació del cristal i el patró de difracció, s'utilisa la construcció coneguda com esfera de Ewald. L'esfera de Ewald ilustra totes les possibles direccions en que els rajos X poden ser reflectits pel cristal. El radi d'esta esfera és $1/\lambda$ i el seu extrem en la direcció del fes de rajos X incident coincidix en l'orige de la ret recíproca.

Si un punt de la ret recíproca de coordenades $(h,k,l)$ es troba sobre la superfície de l'esfera de Ewald, els plans de Miller en índexs $(h,k,l)$ donaran lloc a un punt de difracció en la direcció definida pel centre de l'esfera i eixe punt de la ret recíproca. La distància entre l'orige i $(h,k,l)$ és $1/d$, per lo que es pot demostrar geomètricament que esta condició de difracció és equivalent a la llei de Bragg.

El factor d'estructura cristalí

Artícul principal → factor d'estructura.

El vector en coordenades $(h,k,l)$ en la ret recíproca és perpendicular al pla de reflexió i la seua magnitut és $1/d=2\sin \theta /\lambda$; és dir, és un vector de dispersió $𝐒$, introduït en la definició del factor d'estructura $𝐅(𝐒)$, per al que es complix la llei de Bragg. Per lo tant, el factor d'estructura en la direcció definida pels plans de Miller descrits pels índexs $(h,k,l)$ es reformula com

${𝐅}_{hkl}=\sum _j{f}_j\exp (2\pi i{𝐫}_j\cdot 𝐒)=\sum _j{f}_j\exp (2\pi i(x_{j}h+y_{j}k+z_{j}l))$

a on $(x,y,z)$ és el vector de coordenades de l'àtom $j$ en el sistema definit per la cela unitat i la suma es realisa per a tots els àtoms continguts en ella. En lloc de sumar les contribucions de cada àtom, també es pot realisar una integració sobre els electrons en el volum $V$ de la cela unitat, la distribució de la qual per element de volum es representa per la funció de densitat electrònica $\rho (x,y,z)$:

${𝐅}_{hkl}=\underset{x}{\int }\underset{y}{\int }\underset{z}{\int }\rho (x,y,z)\exp (2\pi i(xh+yk+zl))dzdydx$

Archiu:Friedel's law.svg

Representació vectorial de la Llei de Friedel en l'absència d'absorció. Les magnituts dels factors d'estructura relacionats per esta llei, coneguts com a «parells Friedel» són iguals, i les seues fases, opostes.

L'aplicació de les operacions de simetria del cristal a les coordenades $(x,y,z)$ resulta en relacions d'igualtat entre els factors d'estructura de diferents reflexions. A les reflexions aixina relacionades li les denomina «simétricamente equivalents». En els experiments cristalográficos, a on el grup de simetria no es coneix en certea a priori, es comparen les reflexions relacionades per diverses operacions de simetria per a caracterisar la simetria del cristal. L'igualtat entre els mòduls o «amplitut» de les reflexions relacionades per un centre d'inversió, en índexs de Miller $(h,k,l)$ i $(-h,-k,-l)$

$|{𝐅}_{hkl}|=|{𝐅}_{\overline{h}\overline{k}\overline{l}}|$

es coneix com llei de Friedel i ocorre inclús en l'absència de simetria, a banda de la translació de la cela unitat sobre la ret cristalina. En la pràctica la llei de Friedel no es complix exactament per la presència d'interacciones inelásticas entre els rajos X i els àtoms, que resulten en absorció d'energia per estos. Eixos efectes solen ser menuts comparats en les interaccions elàstiques i no se solen tindre en conte, llevat para llongituts d'ona en el veïnat d'una discontinuïtat d'absorció del cristal.