Cromatografía líquida d'alta eficàcia
La cromatografía líquida d'alta eficàcia (HPLC) (per les seues sigles en anglés de High Performance Liquid Chromatography), és una modalitat de cromatografía líquida en columna que es caracterisa per l'ocupació de farcidures de fase estacionaria de reduït tamany de partícula (de fins a 3 μm), en lo que es conseguix una millora substancial en l'eficàcia separativa, tant en lo que a resolució dels soluts es referix, com en lo relatiu al temps amprat en l'anàlisis, per lo que també es denomina, alternativament, cromatografía líquida d'alta resolució. Donada l'important millora en les prestacions, esta modalitat d'cromatografía líquida no precisa de llargues columnes, sent lo habitual que estes no excedixquen dels 25 cm de llongitut. Respecte al diàmetro de les columnes, estes també són més estretes que les utilisades en la modalitat clàssica (de 2 a 5 mm de diàmetro intern).[1] Esta modalitat d'cromatografía és d'us freqüent en l'anàlisis químic i bioquímic.
L'ocupació de columnes estretes en farcidures de fase estacionaria de chicotet diàmetro de partícula implica una major resistència al pas del eluyente a través de la fase estacionaria, per lo que és necessari amprar elevades pressions, que poden aplegar a alcançar les 450 atm (45 MPa) en la finalitat d'obtindre cabals constants de 0,5 a 5 ml/min, és per això que, a voltes, a esta modalitat d'cromatografía se li denomina cromatografía líquida d'alta pressió.
Tècniques de HPLC
[editar | editar còdic]La separació cromatogràfica de soluts per mig de HPLC pot portar-se a terme per mig de diferents procediments o tècniques. Les més importants són:
Cromatografía de fase normal
[editar | editar còdic]La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) va ser el primer tipo de sistema HPLC utilisat en el camp de la química, i es caracterisa per separar els composts sobre la base de la seua polaridad.[2] Esta tècnica utilisa una fase estacionaria polar i una fase mòvil apolar i s'utilisa quan el compost d'interés és prou polar. El compost polar s'associa i és retingut per la fase estacionaria. La força d'absorció aumenta a mida que aumenta la polaridad del compost i l'interacció entre el compost polar i la fase estacionaria polar (en comparació a la fase mòvil) aumenta el temps de retenció.
La força d'interacció no només depén dels grups funcionals del compost d'interés, sino també en factors estéricos, de manera que els isòmers estructurals a sovint es poden diferenciar l'u de l'atre. L'utilisació de dissolvents més polars en la fase mòvil disminuïx el temps de retenció dels composts mentres que els dissolvents més hidrofòbics tendixen a aumentar el temps de retenció.
La NP-HPLC va caure en desús en els anys 1970 en el desenroll de la HPLC de fase inversa o reversed-phase HPLC. En la NP-HPLC existia poca reproducibilidad dels temps de retenció, ya que els dissolvents próticos canviaven l'estat d'hidratació de la gel de sílice o alúmina de la cromatografía.
Cromatografía de fase inversa (o reversa)
[editar | editar còdic]La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) ampra fases estacionarias apolar i fases mòvils de polaridad moderada. Una de les fases estacionarias més comunes d'este tipo d'cromatografía és un líquit unit químicament a un soport sòlit per mig de enllaç covalente, per lo que es podria parlar de un pseudo-líquit, donant lloc a la cromatografía de fase lligada. El soport sòlit sol ser gel de sílice tractada en RMe2SiCl, a on la R és una cadena d'alcano tal com C18H37 o C8H17. El temps de retenció és major per a les molècules de naturalea apolar, mentres que les molècules de caràcter polar eluyen més ràpidament.[3]
El temps de retenció aumenta en l'adició de dissolvent polar a la fase mòvil i disminuïx en l'introducció de dissolvents més hidrofòbics. La cromatografía de fase reversa és tan utilisada, que a sovint li la denomina HPLC sense cap especificació adicional. La cromatografía de fase reversa es basa en el principi de les interaccions hidrofòbiques que resulten de les forces de repulsió entre un dissolvent relativament polar, un compost relativament apolar, i una fase estacionaria apolar. La força conductora en l'unió del compost a la fase estacionaria és la disminució de l'àrea del segment apolar del analito expost al dissolvent. Este efecte hidrofòbic està dominat per l'aument de l'entropía, i la conseqüent disminució de l'energia lliure, associada en la minimisació de la interfase compost-dissolvent polar. L'efecte hidrofòbic disminuïx en l'adició de dissolvent apolar a la fase mòvil. Açò modifica el coeficient de partició, de manera que el compost es mou per la columna i eluye.
Les característiques del compost d'interés juguen un paper molt important en la retenció. En general, un compost en una cadena alquil llarga s'associa en un temps de retenció major perque aumenta la hidrofobicidad de la molècula. Aixina i tot, les molècules molt grans poden vore reduïda l'interacció entre la superfície del compost i la fase estacionaria, ya que no poden entrar en els poros més menuts de la fase estacionaria. El temps de retenció aumenta en l'àrea de superfície hidrofòbica que sol ser inversamente proporcional al tamany del compost. Els composts ramificados solen eluir més ràpidament que els seus isòmers llineals posat que la superfície total es veu reduïda.
A banda de la hidrofobicidad de la fase immòvil, atres modificacions de la fase mòvil poden afectar la retenció del compost; per eixemple, l'adició de sales inorgàniques provoca un aument llineal en la tensió superficial, i com la entropía de la interfase compost-dissolvent està controlada precisament per la tensió superficial, l'adició de sals tendix a aumentar el temps de retenció.
Una atra variable important és el pH, ya que pot canviar la hidrofobicidad del compost. Per este motiu, la majoria de métodos utilisen un tampó com el fosfat de sodi per a controlar el valor del pH. Estos tampons controlen el pH, pero també neutralisen la càrrega o qualsevol restant de silica de la fase estacionaria que haja quedat exposta i actuen com contraiones que neutralisen la càrrega del compost. L'efecte dels tampons sobre la cromatografía pot variar, pero en general milloren la separació cromatogràfica.
Les columnes de fase reversa es tiren a perdre en menor facilitat que les columnes de silica normals. Aixina i tot, moltes columnes de fase reversa estan formades per silica modificada en cadenes alquil i no es deuen utilisar mai en bases en mig acuoso, ya que estes podrien danyar l'esquelet de silica subjacent. Les columnes es poden utilisar en àcits en mig acuoso pero no deurien estar expostes massa temps a l'àcit perque pot corroer les parts metàliques de l'aparat de HPLC.
Cromatografía bidimensional
[editar | editar còdic]És un procediment o tècnica cromatogràfica en el que tots els components separats de la mostra, o alguns d'ells, se someten a una etapa d'adicional de separació. En la cromatografía líquida d'alta eficàcia açò es conseguix per mig de l'acoplament de dos sistemes cromatògrafs per mig d'una vàlvula de desplaçament d'alta pressió que permeta, en un moment donat, trasferir la mostra des d'una columna inicial a una segona columna a on es completa la separació.[4][5] La tècnica es pot utilisar per a una major resolució de mescles complexes que no es poden separar per complet en un sol mig, per a la neteja de mostres eliminant la matriu o els composts que interferixen, per a aumentar el rendiment de la mostra i per a l'enriquiment de traces de composts menors d'interés. En la versió més popular d'cromatografía bidimensional, solament un o un reduït número de composts d'interés es transferixen al segon sistema de separació. No obstant, en els casos en que es requerix la caracterisació completa de mescles complexes, tots els components de la mostra injectada en la primera columna es transferixen a la segona columna. En este cas, el procés es denomina cromatografía bidimensional “integral” (o "completa") i encara que es tracta de HPLC, se sol expressar per mig de la notació curta LCxLC. En atres casos, l'interés analític esta en la separació i anàlisis d'una part de la mostra. És este cas solament es transferix un grup de picos des del primer cromatògraf al segon, per lo que el procés es coneix com a cromatografía bidimensional “llineal” o “de brot en cor”, que generalment s'abrevia en un guion (és dir, LC-LC) com si es tractar de l'acoplament de dos cromatògrafs en llínea.[6] Hi ha casos en que es poden aplegar a combinar vàries etapes adicionals de separació. Quan es dona esta situació, la tècnica rep el nom de HPLC multidimensional.
Cromatografía per mig de derivatisació post-columna
[editar | editar còdic]En aquells casos en que els analitos eluídos de la columna cromatogràfica no són fàcils de detectar, be per la seua estructura molecular o be perque el sistema de detecció utilisat no és molt sensible, es pot procedir a la derivatisació per mig de reaccions químiques que milloren les seues característiques. Estes reaccions de derivatisació es porten a terme, en continu, a l'eixida de la columna cromatogràfica i abans d'aplegar ar detector. L'ocupació d'esta tècnica de treball en HPLC, depenent dels reactius derivatisants empleats, pot aplegar a aumentar la sensibilitat en un factor superior a 1000, sobretot quan es porten a terme derivatizaciones per a convertir els soluts que no presenten fluorescència en molècules fluorescents i s'utilisa un detector d'este tipo, molt més sensible que els detectors d'absorció ultravioleta-visible. La derivatisació també pot tindre lloc abans que la mostra entre en la columna. En estos casos la tècnica es coneix com a cromatografía per mig de derivatisació pre-columna.[5]
Classificació segons el mecanisme de separació
[editar | editar còdic]La separació cromatogràfica per mig de HPLC es basa en diferents mecanismes de separació. En funció del mecanisme predominant, la cromatografía líquida d'alta eficàcia rep els noms de:
Cromatografía d'adsorció
[editar | editar còdic]La separació es basa fonamentalment en les distintes afinitats d'adsorció dels components de la mostra cap a la superfície d'un sòlit actiu.[5] Generalment estan implicats fenomens de fisisorción del tipo forces de Van der Waals i enllaces d'hidrogen. La fase estacionaria presenta centres actius en dipols permanents o induïts o també terminals en radicals -OH lliures. Es caracterisa per utilisar una fase estacionaria sòlida (adsorbent) de caràcter polar i una fase mòvil líquida (eluyente) apolar, per lo que seria el mecanisme habitual en que es basa la cromatografía líquida d'alta eficàcia en fase normal (NP-HPLC).
Cromatografía de repartiment
[editar | editar còdic]És el tipo d'cromatografía de líquits d'alta eficàcia (HPLC), més àmpliament utilisat. En esta modalitat, la fase estacionaria és un líquit retingut sobre un soport sòlit i inmiscible en la fase líquida mòvil per lo que la separació es produïx com a conseqüència de la diferències de solubilidad dels soluts en la fase estacionaria i en la fase mòvil. Depenent de com es disponga la polaridad de la fase fase mòvil, la tècnica de separació pot portar-se a terme per mig de cromatografía líquida de repartiment en fase fase normal (NP-HPLC) o en fase inversa (RP-HPLC).
La cromatografía líquida de repartiment en fase fase normal (NP-HPLC) utilisa d'un líquit polar, unit per mig d'adsorció física a un soport. El líquit adsorbido que constituïx la fase estacionaria deu ser inmiscible en la fase mòvil; pot ser qualsevol pero normalment és de tipo polar i retingut sobre un soport polar, usualment sílice, a l'objecte de que les forces de adsorció entre la fase estacionaria líquida i el soport de sílice siguen intenses, minimisant la lliberació de el líquit de la fase estacionaria. La separació es produïx en repartir-se els soluts en funció de la solubilidad d'estos. Generalment els soluts més polars són retinguts més fortament que els apolares. No obstant, quan s'utilisa sílice com a soport sòlit les interaccions no són de partició pura, ya que també poden poden contribuir a la separació les interaccions relacionades en els mecanismes d'adsorció, si be la partició sol ser el mecanisme primari d'interacció.[7]
En cromatografía líquida de repartiment en fase inversa (RP-HPLC) lo que s'unix al soport de sílice és un líquit apolar o més be, un radical químic unit covalentement, lo que li conferix major estabilitat a la fase estacionaria, per lo que a voltes també se li denomina cromatografía líquida de fase lligada[7]. En ser la fase estacionaria molt apolar (les radicals units a la sílice poden ser cadenes hidrocarbonadas de huit carbono (C8) o de díhuit(C18)) per a que es produïxca el repartiment dels soluts entre esta fase i la fase mòvil, esta última té que ser relativament polar, per lo que habitualment es forma per mig de mescles d'aigua en metanol, acetonitrilo i ocasionalment tetrahidrofurano, dissolvents orgànics en grups polars.
Cromatografía d'exclusió molecular
[editar | editar còdic]La cromatografía d'exclusió molecular, també coneguda com a cromatografía per filtració en gel, separa les partícules de la mostra en funció del seu tamany.[8] Generalment es tracta d'una cromatografía de baixa resolució, de manera que se sol utilisar en els passos finals del procés de purificació. També és molt útil per a la determinació de l'estructura terciaria i l'estructura cuaternaria de les proteïnes purificades.
La cromatografía de filtració molecular és un método d'cromatografía en columna pel qual les molècules se separen segons el seu pes molecular, o més precisament, segons el seu ràdio de Stokes.
En esta cromatografía, la fase estacionaria consistix en llarcs polímero entrecreuats que formen una ret tridimensional porosa. Als fins pràctics, la columnes s'empaqueten en chicotetes partícules esferoidals formades per eixos polímero entrecreuats. En conseqüència, estes partícules són porosas, i el tamany dels poros és tal que algunes molècules (les massa grans) no podran ingressar a eixos poros, mentres que unes atres (les suficientment menudes) podran passar lliurement. Els poros queden conectats formant una malla o ret, lo que determina una série de camins a ser recorreguts per les molècules que accedixen a l'interior d'esta. Per tant, les molècules de major tamany ixen en primer lloc de la columna, en quedar-se menys retingudes en els poros, mentres que les més chicotetes eixiran en últim lloc.[9]
Cromatografía de ions o d'intercanvi iònic
[editar | editar còdic]- Artícul principal → Cromatografía d'intercanvi iònic.
En la cromatografía d'intercanvi iònic, la retenció es basa en l'atracció electrostàtica entre els ions en solució i les càrregues immovilisades a la fase estacionaria.[10] Els ions de la mateixa càrrega són exclosos mentres que els de càrrega oposta són retinguts per la columna. Alguns tipos de bescanviadors iònics són: i) Resines de poliestireno, ii) bescanviadors iònics de celulosa i dextranos (geles) i iii) Silica porosa o vidre de tamany de poro controlat. En general els bescanviadors iònics favorixen l'unió de ions en elevada càrrega i radi menut. Un increment en la concentració del contraión (respecte als grups funcionals de la resina) reduïx el temps de retenció. Un increment en el pH reduïx el temps de retenció en les cromatografía d'intercanvi catiónico mentres que una disminució del pH reduïx el temps de retenció en les cromatografía d'intercanvi aniónico. Este tipo d'cromatografía és àmpliament utilisat en les següents aplicacions: purificació d'aigua, concentració de components traça, cromatografía de proteïnes per afinitat a metals immovilisats (IMAC), cromatografía de proteïnes per intercanvi iònic, cromatografía de carbohidrats i oligosacàrits per intercanvi d'aniones a elevat pH, etc.
Cromatografía basada en bioafinidad
[editar | editar còdic]Este tipo d'cromatografía es basa en la capacitat de les substàncies biològicament actives de formar complexos estables, específics i reversibles. La formació d'estos complexos involucra la participació de forces moleculars com les interacciones de Van der Waals, interaccions electrostàtiques, interacciones dipol-dipol, interaccions hidrofòbiques i ponts d'hidrogen entre les partícules de la mostra i la fase estacionaria.[11]
Cromatografía líquida d'alta eficàcia en condicions desnaturalisants (DHPLC)
[editar | editar còdic]- Artícul principal → Cromatografía líquida desnaturalisant d'alt rendiment.
Es tracta d'un método que s'ampra per al rastreig de mutacions (ya casi totalment en desús per l'auge de la seqüenciació), que permet detectar la presència de variacions en l'ADN encara que no es determinen específicament quins. En este cas, s'utilisa la tècnica cromatogràfica per a la detecció de heterodúplex de ADN, en lloc d'utilisar un gel per a córrer les molècules d'àcits nucleicos.
El procediment consistix en desnaturalizar (aumentant la temperatura normalment) una mostra que continga tant el ADN problema com un ADN control, que no és més que el mateix ADN problema pero en la seua versió selvada o normal (sense mutacions). Després es procedix a renaturalizar (disminuint la temperatura), de manera que aquelles cadenes de ADN que tornen a unir-se en les seues respectives complementàries (cadena "a" selvat en cadena "b" selvat; o be cadena "a" mutante en cadena "b" mutante) no presentaran diferència en l'estat original; no obstant, si per eixemple una cadena "a" selvat híbrida en una cadena "b" mutante, aquella regió (més o menys àmplia) en la que existixca mutació no complementarà, formant-se un bucle o forqueta, és dir, una regió en la que les bases nitrogenades no són complementàries i no establixen les unions característiques per ponts d'hidrogen en la doble hèliç de ADN. Dites estructures són els denominats heterodúplex (dúplex de ADN híbrits). Estos heterodúplex migran de forma diferent als homodúplex en la columna d'cromatografía de fase reversa (de la mateixa manera que ho fan en un gel d'agarosa o acrilamida). La separació es realisa en condicions desnaturalisants variables, detectant-se les molècules de ADN medint la absorbancia a 260 nm. Açò origina un pico de elución a un temps característic. A mida que s'incrementen les condicions desnaturalisants els heterodúplex migran per davant dels homodúplex, apareixent els picos corresponents a heterodúplex abans en el gràfic resultant, l'cromatograma. D'esta manera, com els heterodúplex es desnaturalizan a temperatures distintes als homodúplex, abdós molècules donen lloc a picos de elución distints.[12]
Previ al procés inicial de desnaturalización se sol portar a terme una PCR per a l'amplificament de el ADN mòle en fragments d'unes 150-450 pb.
En este sistema poden detectar-se fàcilment substitucions d'una base, insercions o deleciones, en un cost reduït i de manera ràpida (aproximadament 16 minuts).[13]
Cromatografía quiral
[editar | editar còdic]La cromatografía quiral permet separar els estereoisómeros d'una mescla racémica de substàncies que presenten asimetria quiral. Els enantiómeros o isòmers òptics de les substàncies quirales es caracterisen per tindre les mateixes propietats químiques i físiques i per tant la mateixa reactivitat química. Solament es diferencies en la seua activitat òptica, ya que un dels enantiómeros gira el pla de la llum polarisada cap a l'esquerra (isòmer L) mentres que l'atre ho fa cap a la dreta (isòmer D). En conseqüència, este tipo de substàncies són molt difícils de separar, puix en compartir les mateixes propietats físiques i químiques no es veuen afectats per la majoria de métodos de separació, incloses les tècniques cromatogràfiques tradicionals. No obstant, en la naturalea, cada enantiómero presenta activitats biològiques molt diferents entre sí, lo que juga un paper molt important en numerosos processos naturals. En el cas de substàncies xenobióticas, com a productes farmacèutics, agroquímicos, etc., pot ocórrer que cada enantiómero present comportaments molt diferents i per lo general, solament una de les formes enantioméricas és activa biològicament tal i com va quedar demostrat despuix de la crisis sanitària causada pel fàrmac talidomida.[14]
Per a la separació dels enantiómeros, la cromatografía líquida d'alta eficàcia representa el método més popular i àmpliament utilisat en l'anàlisis d'una gran varietat de mescles racémicas.[15] Per a la separació cromatogràfica es pot operar de dos maneres diferents:
- Afegir un compost enantioméricamente pur a la fase mòvil que actua com a selector quiral, que forma un complex diastereoisomérico transitori preferent en un dels dos diastereoisómeros, per lo que en canviar les propietats físiques d'abdós isòmers, també canvien les seues interaccions en la fase estacionaria, per lo que poden aplegar a separar-se.
- Utilisar fases estacionarias quirales, formades per partícules polimèriques o de sílice a les que se'ls unix una molècula, generalment voluminosa, en propietats quirales i que es coneix com a selector quiral. Existixen numeroses substàncies que es poden utilisar com a sectors quirales en este tipo d'cromatografía, sent els més importants i àmpliament utilisats: alguns polisacàrits, ciclodextrinas, antibiòtics glicopéptidos macrocíclicos, proteïnes, éter corona i molts atres composts[15]
Esta segona opció és la més utilisada en l'actualitat i la separació es produïx per les diferents possibilitats d'interacció entre els enantiómeros i el selector quiral unit a la fase estacionario. Entre abdós es produïxen interaccions de tipo enllace d'hidrogen, π-π o formació de dipols i atres similars. Depenent del selector quiral de la fase estacionaria, l'interacció pot ser més intensa o menys, de modo que la seua estructura "encaixa" millor en un dels enantiómeros. Per tant, el temps de retenció d'un d'ells és superior, lo que permet separar una mescla racémica en dos composts enantiómeros purs.[14]
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Harris, Daniel C. (1992). «Cap. 23-3 Cromatografía de líquits d'alta resolució», Anàlisis Químic Quantitatiu, Grup Editorial Iberoamericana. ISBN 970-625-003-4.
- ↑ «Fase reversa i Fase normal» (en és-co). Quimicontrol S.A.S. Consultat el 2022-12-14.
- ↑ «Diferencia entre cromatografía en fase inversa i fase normal» (en és). Ciència I Senyes. Consultat el 2022-12-14.
- ↑ Journal of the American Chemical Society.124(46)
- 13959–13960.ISSN 0002-7863.doi:10.1021/ja0252328.Consultat el 2024-04-17.
- ↑ 5,0 5,1 5,2 Ettre, L. S.. «Cap. 1.6 Tècniques especials», Grup d'Cromatografía i Tècniques Afins (RSEQ) (ed.). Manual per a cromatografía, p. 13. ISBN 84-605-2385-3.
- ↑ Biomedical Chromatography.28(1)
- 59–83.ISSN 0269-3879.doi:10.1002/bmc.3007.Consultat el 2024-04-15.
- ↑ 7,0 7,1 Pol Díez, Luis M. (2015). Fonaments d'cromatografía, Madrit: Dextra, p. 262-263. ISBN 978-84-16277-58-2.
- ↑ «Cromatografía d'exclusió molecular» (en és). VWR. Consultat el 2022-12-14.
- ↑ Analytica Chimica Acta.1151
- 338244.ISSN 0003-2670.doi:10.1016/j.aca.2021.338244.Consultat el 2022-11-18.
- ↑ Tens que especificar urlarchiu = i fechaarchiu = al usar {{cita web}}.Waters Corporation. «Columnes- Métodos de separació». Archivat des d'el original, el 14/12/2022.
- ↑ «¿Qué és i cóm funciona la cromatografía d'afinitat? | Net Interlab.» (en és). Net Interlab. Consultat el 2022-12-14.
- ↑ Current Protocols in Human Genetics.48(1)ISSN 1934-8266.doi:10.1002/0471142905.hg0710s48.Consultat el 2022-12-14.
- ↑ Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost detection of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of Neuroscience Methods, 139:263-269
- ↑ 14,0 14,1 Herráiz Carasa, Marta; Calvo Rodríguez, {{{nom2}}} (2011). Resolució enantiomérica de composts volàtils quirales per mig de tècniques multidimensionales : cromatografía en llit mòvil simulat en fluídos supercríticos, Universitat Complutense de Madrit. OCLC 847722017. ISBN 9788469509890.
- ↑ 15,0 15,1 Ali, Imran; Aboul-Enein, {{{nom2}}} (2004). «Cap. 7 The Analysis of Chiral Pollutants by High Performance Liquid Chromatography», Chiral pollutants: distribution, toxicity, and analysis by chromatography and capillary electrophoresis (en Anglés), J. Wiley. ISBN 978-0-470-86780-8.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Cromatografía líquida de alta eficacia» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.