Síntesis artificial de gens

La síntesis artificial de gens, o simplement síntesis de gens, es referix a un grup de métodos que s'usen en biologia sintètica per a construir i ensamblar gens a partir de nucleòtits de novo. A diferència de la síntesis de ADN en cèlules vives, la síntesis artificial de gens no requerix ADN mòle, lo que permet sintetisar pràcticament qualsevol seqüència de ADN en el laboratori. Comprén dos passos principals, el primer dels quals és la síntesis de ADN en fase sòlida, a voltes coneguda com a impressió de ADN. Açò produïx fragments d'oligonucleótidos que generalment tenen menys de 200 parells de bases. La segona etapa implica llavors conectar estos fragments de oligonucleótidos usant varis métodos d'ensamblage de ADN. Degut a que la síntesis artificial de gens no requerix ADN mòle, en teoria és possible fabricar una molècula de ADN completament sintètica sense llímits en la seqüència de nucleòtits o el tamany.

La síntesis del primer gen complet, un ARNt de rent, va ser demostrada per Har Gobind Khorana i colaboradors en 1972. La síntesis dels primers gens codificantes de péptidos i proteïnes es va realisar en els laboratoris d'Herbert Boyer i Alexander Markham, respectivament. Més recentment, s'han desenrollat métodos artificials de síntesis de gens que permetran l'ensamblage de cromosomes i genomes complets. El primer cromosoma sintètic de rent es va sintetisar en 2014, i també s'han sintetisat cromosomes bacterians funcionals complets. Ademés, la síntesis artificial de gens podria fer us en el futur de nous parells de nucleobases (parells de bases no naturals).

Métodos estàndar per a la síntesis de ADN

Síntesis de oligonucleótidos

Els oligonucleótidos se sintetisen químicament utilisant components bàsics cridats nucleòsits fosforamiditos. Estos poden ser nucleòsits normals o modificats que tenen grups protectors per a evitar que les seues amina, grups hidroxilo i grups fosfat interactuen incorrectament. S'agrega una fosforamidita al mateix temps, es desprotege el grup hidroxilo 5' i s'agrega una nova base, i aixina successivament. La cadena creix en la direcció 3' a 5' , que és cap a arrere en relació en la biosíntesis. Al final, s'eliminen tots els grups protectors. No obstant, en tractar-se d'un procés químic, es produïxen vàries interaccions incorrectes que donen lloc a alguns productes defectuosos. Quant més llarga és la seqüència de oligonucleótidos que s'està sintetisant, més defectes hi ha, per lo que este procés solament és pràctic per a produir seqüències curtes de nucleòtits. El llímit pràctic actual és d'aproximadament 200 pb (pares de bases) per a un oligonucleótido en calitat suficient per a usar-se directament per a una aplicació biològica. La HPLC es pot usar per a aïllar productes en la seqüència adequada. Mentrestant, es pot sintetisar una gran cantitat de oligos en paralel en chips genètics. Per a un rendiment òptim en procediments de síntesis gènica posteriors, deuen preparar-se individualment i a major escala.

Conexió basada en hibridació de oligonucleótidos

Normalment, s'elabora un conjunt de oligonucleótidos dissenyats individualment en sintetisadors automàtics de fase sòlida, es purifiquen i després es conecten per mig d'hibridació específica i ligación estàndar o reaccions de polimerasa. Per a millorar la especificidad de l'hibridació de oligonucleótidos, l'etapa de síntesis es basa en un conjunt d'enzimes ADN ligasa i polimerasa termoestables. Fins a la data, s'han descrit varis métodos per a la síntesis gènica, com la ligación de oligonucleótidos solapantes fosforilados,el método Fok I i una forma modificada de reacció en cadena de la ligasa per a la síntesis gènica. Ademés, s'han descrit varis enfocaments d'ensamblage de PCR. Usualment ampren oligonucleótidos de 40-50 nucleòtits de llongitut que se superponen entre sí. Estos oligonucleótidos estan dissenyats per a cobrir la major part de la seqüència d'abdós cadenes, i la molècula de llongitut completa es genera progressivament per mig de PCR d'extensió superposta (OE), PCR termodinámicamente equilibrada d'adins cap a fòra (TBIO) o enfocaments combinats. Els gens sintetisats més comunament varien en tamany de 600 a 1200 pb, encara que s'han creat gens molt més llarcs conectant fragments ensamblados prèviament de menys de 1000 pb. En este interval de tamanys, és necessari ensajar varis clones candidats, confirmant la seqüència del gen sintètic clonat per mig de métodos de seqüenciació automatizado.

Llimitacions

Ademés, degut a que l'ensamblage del producte gènic de llongitut completa es basa en el alineamiento eficient i específic de oligonucleótidos monocatenarios llarcs, els paràmetros crítics per a l'èxit de la síntesis inclouen regions de seqüència estesa que comprenen estructures secundàries causades per repeticions invertides, contingut de GC extraordinàriament alt o baix o estructures repetitives. Per lo general, estos segments d'un gen en particular solament es poden sintetisar dividint el procediment en varis passos consecutius i un ensamblage final de subsecuencias més curtes, lo que a la seua volta conduïx a un aument significatiu en el temps i la mà d'obra necessaris per a la seua producció. El resultat d'un experiment de síntesis gènica depén en gran mida de la calitat dels oligonucleótidos utilisats. Per a estos protocols de síntesis gènica basats en hibridació, la calitat del producte depén directa i exponencialment de la correcció dels oligonucleótidos amprats. Alternativament, despuix de realisar la síntesis gènica en oligos de menor calitat, es deu fer més esforç en la garantia de calitat aigües avall durant l'anàlisis de clons, lo que generalment es realisa per mig de procediments estàndar de clonació i seqüenciació que consumixen molt temps. Un atre problema associat en tots els métodos de síntesis gènica actuals és l'alta freqüència d'errors de seqüència per l'us de oligonucleótidos sintetisats químicament. La freqüència d'error aumenta en oligonucleótidos més llarcs i, com a conseqüència, el percentage de producte correcte disminuïx dràsticament a mida que s'usen més oligonucleótidos. El problema de la mutació podria resoldre's per mig de l'us de oligonucleótidos més curts utilisats per a ensamblar el gen. No obstant, tots els métodos d'ensamblage basats en recocido requerixen que els cebadores es mesclen junts en un tubo. En este cas, els solapamientos més curts no sempre permeten una hibridació precisa de cebadores complementaris, lo que dona com resultat l'inhibició de la formació de productes de llongitut completa. El disseny manual de oligonucleótidos és un procediment laboriós i no garantisa la síntesis exitosa del gen desijat. Per a un rendiment òptim de casi tots els métodos basats en hibridació, se supon que les temperatures de fusió de les regions superpostes són similars per a tots els oligonucleótidos. L'optimisació necessària del cebador deu realisar-se usant programes especialisats de disseny de oligonucleótidos. Fins ara s'han presentat vàries solucions per al disseny automatizado de cebadores per a la síntesis gènica.

Procediments de correcció d'errors

Per a superar els problemes associats en la calitat dels oligonucleótidos, s'han desenrollat vàries estratègies elaborades, amprant oligonucleótidos peixquers preparats per separat enzimes d'unió a desajusts de la família mutS o endonucleasas específiques de bactèries o fagos. No obstant, totes estes estratègies aumenten el temps i el cost de la síntesis gènica basada en l'hibridació de oligonucleótidos sintetisats químicament.

La seqüenciació massiva en paralel també s'ha utilisat per a seleccionar biblioteques complexes de oligonucleótidos i recuperar molècules precises. En un enfocament, els oligonucleótidos es secuencian en la plataforma de pirosecuenciación 454 i un sistema robòtic pren imàgens i arreplega perles individuals corresponents a la seqüència precisa. En un atre enfocament, una biblioteca complexa de oligonucleótidos es modifica en etiquetes flanqueantes úniques abans de la seqüenciació massiva en paralel. Els cebadores dirigits per etiquetes permeten després la recuperació de molècules en les seqüències desijades per mig de PCR de marcació.

Cada volta més, els gens s'ordenen en conjunts que inclouen gens funcionalmente relacionats o múltiples variants de seqüència en un sol gen. Pràcticament totes les proteïnes terapèutiques en desenroll, com els anticossos monoclonales, s'optimisen provant moltes variants genètiques per a millorar la funció o expressió. L'optimisació de codones té aplicacions en el disseny de gens sintètics i vacunes de ADN. Les ferramentes recents inclouen models d'aprenentage automàtic com ColiFormer, que utilisen característiques de seqüència per a guiar l'optimisació de codones; una implementació oberta està disponible com un Hugging Face Space.

Parells de bases antinaturals

Mentres que la síntesis tradicional de àcit nucleicos solament usa 4 parells de bases: adenina, timina, guanina i citosina, la síntesis de oligonucleótidos en el futur podria incorporar l'us de parells de bases no naturals, que són nucleobases dissenyades i sintetisades artificialment que no ocorren en la naturalea.

En 2012, un grup de científics nortamericans dirigit per Floyd Romesberg, biòlec químic del Institut d'Investigació Scripps en Sant Diego, Califòrnia, va publicar que el seu equip va dissenyar un parell de bases antinatural (UBP). Els dos nous nucleòtits artificials o Parells de Bases No Naturals (UBP) es varen denominar d5SICS i dNaM. Més tècnicament, estos nucleòtits artificials que porten nucleobases hidrófobas presenten dos anells aromàtics fusionats que formen un complex (d5SICS–dNaM) o un parell de bases en el ADN. En 2014, el mateix equip de l'Institut d'Investigació Scripps va informar que varen sintetisar un tram de ADN circular conegut com plásmido que contenia parells de bases T-A i C-G naturals junt en el UBP de millor rendiment que havia dissenyat el laboratori de Romesberg, i ho varen insertar en cèlules de la bactèria comuna E. coli que va replicar en èxit els parells de bases antinaturals a través de múltiples generacions. Est és el primer eixemple conegut d'un organisme viu que transmet un còdic genètic expandit a generacions posteriors. Açò es va conseguir en part per mig de l'adició d'un gen d'algues de respal que expressa un transportador de trifosfato de nucleòtits, que importa eficientemente els trifosfatos tant de d5SICSTP com de dNaMTP a la bactèria E. coli. Després, les vies naturals de replicació bacteriana les usen per a replicar en precisió el plásmido que conté d5SICS-dNaM.

L'incorporació exitosa d'un tercer parell de bases és un alvanç significatiu cap a l'objectiu d'expandir en gran medida el número d'aminoàcits que pot codificar el ADN, dels 20 aminoàcits existents als 172 teòricament possibles, expandint aixina el potencial dels organismes vius per a produir noves proteïnes. En el futur, estos parells de bases antinaturals podrien sintetisar-se i incorporar-se en oligonucleótidos per mig de métodos d'impressió de ADN.

Ensamblage de ADN

Per lo tant, l'impressió de ADN pot usar-se per a produir parts de ADN, que es definixen com seqüències de ADN que codifiquen una funció biològica específica (per eixemple, promotors, seqüències reguladores de la transcripció o marcs de llectura oberts). No obstant, degut a que la síntesis de oligonucleótidos generalment no pot produir en precisió seqüències de oligonucleótidos de més d'uns pocs centenars de parells de bases, es deuen amprar métodos d'ensamblage de ADN per a ensamblar estes parts per a crear gens funcionals, circuits multigénicos o inclús cromosomes o genomes sintètics complets. Algunes tècniques d'ensamblage de ADN solament definixen protocols per a unir parts de ADN, mentres que atres tècniques també definixen les regles per al format de les parts de ADN que són compatibles en elles. Estos processos es poden ampliar per a permetre l'ensamblage de cromosomes o genomes complets. En els últims anys, hi ha hagut una proliferació en el número de diferents estàndarts d'ensamblage de ADN, en 14 estàndarts d'ensamblage diferents desenrollats a partir de 2015, cada u en els seus pros i les seues contres. En general, el desenroll d'estàndarts d'ensamblage de ADN ha facilitat enormement el fluix de treball de la biologia sintètica, ha ajudat a l'intercanvi de material entre grups d'investigació i també ha permés la creació de parts de ADN modular i reutilisables.

Els diversos métodos d'ensamblage de ADN es poden classificar en tres categories principals: ensamblage mediat per endonucleasas, recombinació específica de lloc i ensamblage basat en superposició prolongada. Cada grup de métodos té les seues característiques distintives i les seues pròpies ventages i llimitacions.

Ensamblage mediat per endonucleasas

Les endonucleasas són enzimes que reconeixen i escindixen segments d'àcit nucleico i poden usar-se per a dirigir l'ensamblage de el ADN. Dels diferents tipos d'enzimes de restricció, les enzimes de restricció de tipo II són les més comunament disponibles i utilisades perque els seus llocs d'escissió estan ubicats prop o en els seus llocs de reconeiximent. Per lo tant, els métodos d'ensamblage mediats per endonucleasas fan us d'esta propietat per a definir parts de ADN i protocols d'ensamblage.

BioBricks

BBF RFC 10 montage de dos peces compatibles en BioBrick. Tractar el fragment aigües dalt en EcoRI i SpeI, i el fragment aigües avall en EcoRI i XbaI, permet l'ensamblage en la seqüència desijada. Degut a que SpeI i XbaI produïxen eixints complementaris, ajuden a unir els dos fragments de ADN, produint una seqüència scar. Tots els llocs de restricció originals es mantenen en la construcció final, que després es pot usar per a reaccions BioBricks adicionals.

L'estàndart d'ensamblage de BioBricks va ser descrit i introduït per Tom Knight en 2003 i s'ha actualisat constantment des de llavors. Actualment, l'estàndart BioBricks més utilisat és l'estàndart d'ensamblage 10, o BBF RFC 10. BioBricks definix les seqüències de prefix i sufix necessàries per a que una part de ADN siga compatible en el método d'ensamblage de BioBricks, permetent l'unió de totes les parts de ADN que estan en el format BioBricks.

El prefix conté els llocs de restricció per a EcoRI, NotI i XbaI, mentres que el sufix conté els llocs de restricció SpeI, NotI i PstI. Fòra de les regions de prefix i sufix, la part de ADN no deu contindre estos llocs de restricció. Per a unir dos parts de BioBrick, un dels plásmidos es digerix en EcoRI i SpeI, mentres que el segon plásmido es digerix en EcoRI i XbaI. Els dos eixints EcoRI són complementaris i, per lo tant, es hibridarán entre sí, mentres que SpeI i XbaI també produïxen eixints complementaris, que també poden lligar-se entre sí. Com el plásmido resultant conté les seqüències de prefix i sufix originals, pot usar-se per a unir-se en més parts de BioBricks. Per esta propietat, es diu que l'estàndart d'ensamblage de BioBricks és de naturalea idempotent. No obstant, també es formarà una seqüència de "cicatriu" (ya siga TACTAG o TACTAGAG) entre els dos BioBricks fusionats. Açò evita que els BioBricks s'utilisen per a crear proteïnes de fusió, ya que la seqüència scar de 6 pb codifica una tirosina i un codón de parada, lo que fa que la traducció finalise en acabant de que s'expresse el primer domini, mentres que la seqüència scar de 8 pb provoca un desplaçament del marc de llectura, evitant la llectura contínua dels codones. Per a oferir seqüències de cicatrius alternatives que, per eixemple, donen una cicatriu de 6 pb, o seqüències de cicatrius que no continguen codones de terminació, es varen dissenyar atres estàndarts d'ensamblage, com l'Ensamblage BB-2, l'Ensamblage BglBricks, l'Ensamblage Silver i l'Ensamblage Freiburg.

Si ben el método més fàcil per a ensamblar peces de bioladrillo es va descriure anteriorment, també existixen varis atres métodos d'ensamblage comunament utilisats que oferixen vàries ventages sobre l'ensamblage estàndar. L'ensamblage de 3 antibiòtics (3A) permet seleccionar l'ensamblage correcte per mig de la selecció d'antibiòtics, mentres que l'ensamblage d'inserte amplificat busca superar la baixa eficiència de transformació observada en l'ensamblage 3A.

L'estàndart d'ensamblage de BioBrick també ha servit d'inspiració per a usar atres tipos de endonucleasas per a l'ensamblage de ADN. Per eixemple, tant l'estàndart iBrick com els estàndarts d'ensamblage de vectores HomeRun ampren endonucleasas de migració directa en lloc d'enzimes de restricció de tipo II.

Ensamblage de endonucleasas de restricció de tipo II

Alguns métodos d'ensamblage també fan us de endonucleasas de restricció de tipo II. Estes diferixen d'atres endonucleasas de tipo II ya que separen varis parells de bases del lloc de reconeiximent. Com a resultat, la seqüència sobreixent pot modificar-se per a contindre la seqüència desijada. Açò proporciona als métodos d'ensamblage de tipo II dos ventages: permet un ensamblage "sense cicatrius" i permet l'ensamblage de vàries parts en un recipient. Els métodos d'ensamblage que usen endonucleasas de tipo II inclouen Golden Gate i les seues variants associades.

Clonació Golden Gate

La seqüència de parts de ADN per a l'ensamblage Golden Gate es pot dirigir definint eixints complementaris únics per a cada part. Per lo tant, per a ensamblar el gen 1 en l'orde dels fragments A, B i C, l'eixint 3' per al fragment A és complementari a l'eixint 5' per al fragment B, i de manera similar per al fragment B i el fragment C. Per al plásmido de destí, el marcador seleccionable està flanquejat per llocs de restricció BsaI que tallen cap a fòra. Açò elimina el marcador seleccionable, permetent l'inserció de la construcció final. La ligasa T4 s'usa per a lligar els fragments entre sí i en el plásmido de destí.

El protocol d'ensamblage Golden Gate va ser definit per Engler et al. 2008 per a definir un método d'ensamblage de ADN que donaria una construcció final sense una seqüència scar, a l'hora que cariria dels llocs de restricció originals. Açò permet que la proteïna s'expresse sense contindre seqüències de proteïnes no desijades que podrien afectar negativament al plegament o expressió de proteïnes. En usar l'enzima de restricció BsaI que produïx un eixint de 4 parells de bases, es poden usar fins a 240 seqüències úniques no palindrómicas per a l'ensamblage.

Disseny i ensamblage de plásmidos

En la clonació Golden Gate, cada fragment de ADN a ensamblar es coloca en un plásmido, flanquejat per llocs de restricció BsaI orientats cap a dins que contenen les seqüències eixints programades. Per a cada fragment de ADN, la seqüència eixint 3' és complementària a l'eixint 5' del següent fragment de ADN descendent. Per al primer fragment, l'eixint 5' és complementari a l'eixint 5' del plásmido de destí, mentres que l'eixint 3' del fragment final és complementari a l'eixint 3' del plásmido de destí. Tal disseny permet que tots els fragments de ADN es ensamblen en una reacció d'un sol recipient (a on es mesclen tots els reactius), en tots els fragments disposts en la seqüència correcta. Les construccions ensambladas en èxit se seleccionen detectant la pèrdua de funció d'un casset d'erejat que estava originalment en el plásmido de destí.

MoClo i Trena Dorada

L'ensamblage original de Golden Gate solament permet realisar una única construcció en el vector de destí . Per a permetre que esta construcció s'use en una reacció posterior com a vector d'entrada, es varen dissenyar els patrons MoClo i Golden Braid.

L'estàndart MoClo implica definir múltiples nivells d'ensamblage de ADN:

• Nivell 1: L'ensamblage de nivell 1 és l'ensamblage Golden Gate estàndar, i els gens es ensamblan a partir de les seues parts (parts de ADN que codifiquen elements genètics com UTR, promotors, llocs d'unió a ribosoma o seqüències terminadoras). Flanquejant el lloc d'inserció dels vectores de destí de nivell 1 hi ha un parell de llocs de restricció BpiI que tallen cap a dins. Açò permet que estos plásmidos s'usen com vectores d'entrada per a vectores de destí de nivell dos.

• Nivell 2: L'ensamblage de nivell 2 implica ensamblar adicionalment els gens ensamblados en l'ensamblage de nivell 1 en construccions multigénicas. Si existix la necessitat d'un ensamblage adicional de nivell superior, es poden agregar llocs de restricció BsaI de cort cap a dins per a flanquejar els llocs d'inserció. Estos vectores poden usar-se llavors com vectores d'entrada per a construccions de nivell superior.

Cada nivell d'ensamblage alterna l'us de llocs de restricció BsaI i BpiI per a minimisar el número de llocs prohibits, i l'ensamblage seqüencial per a cada nivell es conseguix seguint el disseny del plásmido Golden Gate. En general, l'estàndart MoClo permet l'ensamblage d'una construcció que conté múltiples unitats de transcripció, totes ensambladas a partir de diferents parts de ADN, per mig d'una série de reaccions Golden Gate d'un recipient. No obstant, un inconvenient de l'estàndart MoClo és que requerix l'us de 'parts fictícies' sense funció biològica si la construcció final requerix menys de quatre parts. L'estàndart Golden Braid, per un atre costat, va introduir un estàndart d'ensamblage Golden Gate per parells.

L'estàndart Golden Braid usa el mateix ensamblage escalonat que MoClo, pero cada nivell solament implica l'ensamblage de dos fragments de ADN, és dir, un enfocament per parells. Per lo tant, en cada nivell, els parells de gens es clonen en un fragment de destí en la seqüència desijada, i estos es ensamblan posteriorment de dos en dos en nivells successius. De la mateixa manera que MoClo, l'estàndart Golden Braid alterna les enzimes de restricció BsaI i BpiI entre cada nivell.

El desenroll dels métodos d'ensamblage Golden Gate i les seues variants ha permés als investigadors dissenyar kits de ferramentes per a accelerar el fluix de treball de la biologia sintètica. Per eixemple, EcoFlex es va desenrollar com un kit de ferramentes per a E. Coli que utilisa l'estàndart MoClo per a les seues parts de ADN, mentres que també s'ha desenrollat un kit de ferramentes similar per a dissenyar les microalgas Chlamydomonas reinhardtii.

Recombinació específica del lloc

La recombinació específica de lloc fa us d'integrasas de fagos en lloc d'enzimes de restricció, eliminant la necessitat de tindre llocs de restricció en els fragments de ADN. En canvi, les integrasas fan us de llocs d'unió únics (att) i catalizan la reorganisació de el ADN entre el fragment diana i el vector de destí. El sistema de clonació Gateway de Invitrogen es va inventar a fins de la década de 1990 i utilisa dos mescles d'enzimes patentades, BP clonara i LR clonara. La mescla de clonasas BP cataliza la recombinació entre els llocs attB i attP, generant llocs attL i attR híbrits, mentres que la mescla de clonasas LR cataliza la recombinació dels llocs attL i attR per a donar els llocs attB i attP. Com cada mescla enzimàtica reconeix sol llocs att específics, la recombinació és altament específica i els fragments es poden ensamblar en la seqüència desijada.

Disseny i montage vectorial

Degut a que la clonació de portes d'enllaç és una tecnologia patentada, totes les reaccions de portes d'enllaç deuen portar-se a terme en el kit de portes d'enllaç proporcionat pel fabricant. La reacció es pot resumir en dos etapes. La primera etapa implica ensamblar els clons d'entrada que contenen el fragment de ADN d'interés, mentres que la segona etapa implica insertar este fragment d'interés en el clon de destí.

1. Els clons d'entrada deuen fer-se usant els vectores "Donants" suministrats que contenen un casset de passarela flanquejat per llocs attP. El casset Gateway conté un gen suïcida bacterià (per eixemple, ccdB) que permetrà la supervivència i selecció de clons d'entrada recombinados en èxit. S'agrega un parell de llocs attB per a flanquejar el fragment de ADN d'interés, i açò permetrà la recombinació en els llocs attP quan s'agregue la mescla de BP clonasa. Es produïxen clons d'entrada, i el fragment d'interés està flanquejat per llocs attL.
2. El vector de destí també ve en un casset de porta d'enllaç, pero en canvi està flanquejat per un parell de llocs attR. Mesclar este plásmido de destí en els clons d'entrada i la mescla de clonasa LR permetrà que es produïxca recombinació entre els llocs attR i attL. Es produïx un clon de destí, en el fragment d'interés insertat en èxit. El gen letal s'inserta en el vector original i les bactèries transformades en este plásmido moriran. Per lo tant, el vector desijat pot seleccionar-se fàcilment.

Les primeres iteraciones del método de clonació de porta d'enllaç solament permetien utilisar un clon d'entrada per a cada clon de destí produït. No obstant, investigacions posteriors varen revelar que es podrien generar quatre seqüències att ortogonals més, lo que permetria l'ensamblage de fins a quatre fragments de ADN diferents, i este procés ara es coneix com a tecnologia de Porta d'enllaç Multisitio.

Ademés de la clonació de portes d'enllaç, també s'han desenrollat métodos no comercials que utilisen atres integrasas. Per eixemple, el método d'Ensamblage Recombinacional de Serina Integrasa (SIRA) usa la integrasa ΦC31, mentres que el método d'Ensamblage en Tàndem basat en Recombinació Específica del Lloc (SSRTA) usa la integrasa φBT1 del fago Streptomyces. Atres métodos, com el Sistema d'Ensamblage de Vectores HomeRun (HVAS), es basen en el sistema de clonació Gateway i incorporen ademés endonucleasas de direccionament per a dissenyar un protocol que potencialment podria respalar la síntesis industrial de construccions de ADN sintètic.

Ensamblage basat en superposició llarga

Els métodos d'ensamblage basats en solapamiento prolongat requerixen la presència de regions de solapamiento prolongat en les parts de ADN que es van a ensamblar. Açò permet la construcció de voladizos complementaris que poden recocerse per mig de emparejamiento de bases complementari. Existix una varietat de métodos, per eixemple, ensamblage Gibson, CPEC, MODAL, que fan us d'este concepte per a ensamblar ADN.

En els últims anys s'han desenrollat una varietat de métodos d'ensamblage basats en superposició prolongada. Un dels métodos més utilisats, el método d'ensamblage Gibson, es va desenrollar en 2009 i proporciona un método d'ensamblage de ADN en un recipient que no requerix l'us d'enzimes de restricció o integrasas. Atres métodos d'ensamblage similars basats en superposició inclouen la Clonació per Extensió Circular d'Polimerasa (CPEC), la Clonació Independent de Seqüència i Ligasa (SLIC) i l'Extracte de Clonació per Ligación sense Costura (SLiCE). A pesar de la presència de molts métodos d'ensamblage superposts, el método d'ensamblage Gibson seguix sent el més popular. Ademés dels métodos enumerats anteriorment, atres investigadors s'han basat en els conceptes utilisats en l'ensamblage Gibson i atres métodos d'ensamblage per a desenrollar noves estratègies d'ensamblage, com l'estratègia Modular d'ensamblage dirigit per superposició en Enlazadores (MODAL) o el método Biopart Assembly Standard for Idempotent Cloning (BASIC).

Ensamblage de Gibson

El método d'ensamblage de Gibson és un método d'ensamblage de ADN relativament senzill, que requerix solament uns pocs reactius adicionals: l'exonucleasa 5' T5, l'ADN polimerasa Phusion i l'ADN ligasa Taq. Els fragments de ADN que es van a ensamblar se sintetisen per a que tinguen extrems 5' i 3' superposts en l'orde en que es van a ensamblar. Estos reactius es mesclen en els fragments de ADN a ensamblar a 50 °C i es produïxen les següents reaccions:

1. La exonucleasa T5 mastega el ADN de l'extrem 5' de cada fragment, exponent els eixints 3 ' en cada fragment de ADN.
2. Els eixints complementaris en fragments de ADN adjacents es hibridan per mig de emparejamiento de bases complementàries.
3. La ADN polimerasa Phusion reblix qualsevol buit a on es hibridan els fragments.
4. La ADN ligasa Taq repara les mellas en abdós cadenes de ADN.

Degut a que la exonucleasa T5 és termolábil, s'inactiva a 50 °C despuix de l'etapa inicial de masticació. Per lo tant, el producte és estable i els fragments es ensamblan en l'orde desijat. Este protocol d'un recipient pot ensamblar fins a 5 fragments diferents en precisió, mentres que varis proveïdors comercials tenen kits per a ensamblar en precisió fins a 15 fragments diferents en una reacció de dos passos. No obstant, encara que el protocol d'ensamblage de Gibson és ràpit i utilisa relativament pocs reactius, requerix una síntesis de ADN a mida, ya que cada fragment deu dissenyar-se per a contindre seqüències superpostes en els fragments adjacents i amplificar-se per mig de PCR. Esta dependència de la PCR també pot afectar la fidelitat de la reacció quan s'usen fragments llarcs, fragments en alt contingut de GC o seqüències repetides.

MODAL

Archiu:Overlap assembly using the caps block 278 format.png

L'estàndart MODAL proporciona un format comú per a permetre que qualsevol part de ADN es faça compatible en l'ensamblage Gibson o atres métodos d'ensamblage per superposició. El fragment de ADN d'interés se somet a dos rondes de PCR, primer per a unir els prefixos i sufixos de l'adaptador, i després per a unir les seqüències enlazadoras predefinides. Una volta que les peces estan en el format requerit, es poden portar a terme métodos d'ensamblage com l'ensamblage Gibson. L'orde de les parts està dirigit pels enlazadores, és dir, la mateixa seqüència de enlazadores està unida a l'extrem 3' de la partix aigües dalt i a l'extrem 5' de la partix aigües avall.

L'estratègia MODAL definix seqüències superpostes conegudes com "enlazadores" per a reduir la cantitat de personalisació que deu realisar-se en cada fragment de ADN. Els enlazadores es varen dissenyar usant el software R2oDNA Designer, i les regions de superposició es varen dissenyar per a que tingueren una llongitut de 45 pb per a que foren compatibles en l'ensamblage Gibson i atres métodos d'ensamblage de superposició. Per a unir estos enlazadores a les parts a ensamblar, la PCR es porta a terme usant cebadores específics de la part que contenen seqüències adaptadoras de prefix i sufix de 15 pb. Després, els enlazadores s'unixen a les seqüències adaptadoras per mig d'una segona reacció de PCR. Per a posicionar els fragments de ADN, s'unirà el mateix enlazador al sufix del fragmente aigües dalt desijat i al prefix dels fragments aigües avall desijats. Una volta que s'unixen els enlazadores, es poden usar tots els métodos d'ensamblage Gibson, CPEC o atres métodos d'ensamblage de superposició per a ensamblar els fragments de ADN en l'orde desijat.

BASIC

L'estratègia d'ensamblage BASIC es va desenrollar en 2015 i va buscar abordar les llimitacions de les tècniques d'ensamblage anteriors, incorporant sis conceptes clau d'elles: peces reutilisables estàndart; format d'un sol nivell (totes les peces estan en el mateix format i es ensamblan utilisant el mateix procés); clonació idempotent; ensamblage de ADN paralel (multiparte); independència de tamany; automatizabilidad.

Disseny de parts de ADN i enlazador

Les parts de ADN es dissenyen i clonen en plásmidos d'almagasenament, en la part flanquejada per una seqüència de prefix integrat (iP) i un sufix integrat (iS). Les seqüències iP i iS contenen llocs de restricció BsaI orientats cap a dins, que contenen eixints complementaris als enlazadores BÁSICOS. De la mateixa manera que en MODAL, els 7 enlazadores estàndar utilisats en BASIC es varen dissenyar en el software R2oDNA Designer i es varen seleccionar per a garantisar que no continguen seqüències en homologia en genomes chassis i que no continguen seqüències no desijades com a seqüències d'estructura secundària, llocs de restricció o llocs d'unió ribosómica. Cada seqüència enlazadora es dividix en dos mitats, cada una en un eixint de 4 pb complementari al lloc de restricció BsaI, una seqüència bicatenaria de 12 pb i compartint una seqüència superposta de 21 pb en l'atra mitat. La mitat que s'unirà a la part de ADN descendent es coneix com la part enlazadora de sufix (per eixemple, L1S), i la mitat que s'unix a la partix aigües avall es coneix com la part enlazadora de prefix (per eixemple, L1P). Estos enlazadores formen la base per a ensamblar les parts de ADN.

Ademés de dirigir l'orde d'ensamblage, els enlazadores BASIC estàndart també poden modificar-se per a portar a terme atres funcions. Per a permetre l'ensamblage idempotent, els enlazadores també es varen dissenyar en seqüències adicionals de iP i iS metiladas insertades per a protegir-les de ser reconegudes per BsaI. Esta metilación es pert despuix de la transformació i la replicació del plásmido in viu, i els plásmidos poden extraure's, purificar-se i usar-se per a reaccions adicionals.

Degut a que les seqüències enlazadoras són relativament llargues (45 pb per a un enlazador estàndar), existix l'oportunitat d'incorporar seqüències de ADN funcionals per a reduir el número de parts de ADN necessàries durant l'ensamblage. L'estàndart d'ensamblage BASIC proporciona varis enlazadores incrustats en RB de diferents resistències. De manera similar, per a facilitar la construcció de proteïnes de fusió que contenen múltiples dominis proteics, també es varen dissenyar varis enlazadores de fusió per a permetre la llectura completa de la construcció de ADN. Estos enlazadores de fusió codifiquen un polipèptit de glicina i serina de 15 aminoàcits, que és un péptido enlazador ideal per a proteïnes de fusió en múltiples dominis.

Ensamble

Hi ha tres passos principals en l'ensamblage de la construcció final.

1. En primer lloc, les parts de ADN s'escindixen del plásmido d'almagasenament, donant un fragment de ADN en eixints de BsaI en els extrems 3 'i 5'.
2. A continuació, cada part enlazadora s'unix a la seua part de ADN respectiva incubando en ADN ligasa de T4. Cada part de ADN tindrà un sufix i una part enlazadora de prefix de dos enlazadores diferents per a dirigir l'orde d'ensamblage. Per eixemple, la primera part de la seqüència tindrà L1P i L2S, mentres que la segona part tindrà L2P i L3S unides. Les parts del conector es poden canviar per a canviar la seqüència d'ensamblage.

1. Finalment, les parts en els enlazadores units es ensamblan en un plásmido incubando a 50 °C. Els eixints de 21 pb dels enlazadores P i S es hibridan i la construcció final es pot transformar en cèlules bacterianes per a la clonació. Les muescas monocatenarias es reparen in viu despuix de la transformació, produint una construcció final estable clonada en plásmidos.