SDS-PAGE

Archiu:Caps block 0 .jpg

Image de SDS-PAGE. El marcador molecular corre en el carril de l'esquerra.

SDS-PAGE és l'acrònim en anglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida en dodecilsulfato sòdic). És una tècnica àmpliament utilisada en bioquímica, genètica, biologia molecular i ciència forense per a separar les proteïnas d'acort a la seua movilitat electroforética (en funció de la llongitut de la cadena polipeptídica, massa molecular, modificacions postraduccionales i atres factors). Gràcies a el SDS les proteïnes es desnaturalizan, perdent la seua conformació tridimensional. D'esta manera s'obté un fraccionament que obedix a: la diferència de pes; la llongitut de la cadena (tamany); i la forma de la proteïna. És el método de electroforesis amprat en major profusió per a analisar proteïnes.

Procediment

La dissolució de proteïnes que es van a analisar es mescla en primer lloc en SDS, un detergent aniónico que desnaturaliza les proteïnes, eliminant les seues estructures secundària i terciaria (pero sense alterar els enllaços disulfuro i ademés conferix una càrrega negativa a cada proteïna en proporció a la seua massa). Sense SDS, les distintes proteïnes que tenen masses moleculars similars migran de forma diferent per diferències en la proporció carrega/massa, ya que cada proteïna té un punt isoeléctrico distint. Si la electroforesis es realisa aixina, sense afegir SDS, es parla de PAGE nativa. El problema es resol afegint SDS, ya que en unir-se i desplegar la proteïna, li proporciona una càrrega negativa casi uniforme a lo llarc de la llongitut de la cadena polipéptidica.

El SDS s'unix en una proporció d'aproximadament 1,4 g SDS per 1,0 g de proteïna (encara que les proporcions d'unió poden variar entre 1,1 i 2,2), proporcionant una relació carrega/massa aproximadament uniforme per a la major part de les proteïnes, de modo que es pot assumir que la distància de migració en el gel està directament vinculada solament al tamany de la proteïna desplegada (llongitut de la seua cadena, número d'aminoàcits o massa molecular). Es pot afegir un colorant trazador a la dissolució de proteïnes per a permetre al experimentador seguir el curs de la electroforesis.

Ingredients químics i els seus papers

El gel de poliacrilamida era ya conegut com un mig potencial per a l'inclusió de teixits seccionats en 1959. Es tracta d'un gel sintètic, termoestable, transparent, resistent, relativament inerte, químicament parlant, que pot preparar-se en un ampli interval de tamanys mijos de poro. El tamany de poro d'un gel està determinat per dos factors: la concentració total de acrilamida present (%T) (T = concentració total de monòmers de acrilamida i bisacrilamida) i la cantitat del reticulador (%C) (C = concentració del reticulador). Els tamanys de poro disminuïxen quan aumenta %T, i en reticulación el 5%C produïx el menor tamany de poro. Qualsevol increment o disminució en %C aumenta el tamany de poro (funció parabòlica). Açò sembla deure's a l'estructura no homogénea dels filaments del gel.

El gel format a partir d'este material també pot resistir gradient d'alt voltage, ser viable per a varis procediments d'tinción i destinción i pot ser digerit per a extraure fraccions separades o desecado per a la seua autorradiografía i registre permanent. La electroforesis en disc utilisa geles de distints tamanys de poro. El nom de electroforesis en disc deriva de l'acrònim anglés DISC, que fa referència a les discontinuidades en la matriu electroforética i per coincidència a la forma discoidal de les zones separades de ions. Hi ha dos capes de gel, el gel de apilamiento o espayador i el gel de resolució o separador.

Gel de apilamiento

El gel de apilamiento és un gel de poliacrilamida en tamany de poro gran (4%T). Este gel està preparat en un tampó de Tris/HCl en un pH de 6,8, dos unitats de pH menor que el tampó de electroforesis (Tris/glicina). Estes condicions proporcionen un ambient per a les reaccions de Kohlrausch que determinen la conductivitat molar, i com a resultat, les proteïnes recobertes en SDS es concentren vàries voltes, resultant aixina en pocs minuts una zona d'inici de l'orde de 19 μm. Este gel es coloca sobre el gel de resolució. L'altura de la zona corresponent al gel de apilamiento deu ser superior al doble de l'altura i el volum de la mostra que va a ser aplicada.

Gel de resolució

El gel de resolució és un gel de poliacrilamida de poro menut (3 - 30% de monòmer de acrilamida) que típicament es confecciona utilisant un tampó Tris/HCl en un pH de 8,8. En el gel de resolució és a on les macromolécula se separen d'acort al seu tamany. Els geles de resolució tenen un interval òptim de separació depenent del percentage de monòmer utilisat per a la seua preparació. Per eixemple, es poden utilisar eficaçment geles en continguts de 8%, 10% i 12% per a separar proteïnes de 24 a 205 kDa, 14 a 205 kDa, i 14 a 66 kDa, respectivament.

Ingredients químics

• Tris, nom abreviat del tris (hidroximetil) aminometano (C₄H₁₁NO₃; M_r = 121,14). S'utilisa a sovint com a tampó perque és una substància inocuo per a la major part de les proteïnes. El seu pKa és 8,3 a 20 °C, lo que ho convertix en un tampó idòneu per a l'interval de pH entre 7 i 9.
• Glicina, o àcit aminoacético (C₂H₅NO₂; M_r = 75,07). S'ha utilisat com a font d'ions d'arrastre (o llents) perque el seu pKa és 9,69 i la movilitat del glicinato és tal que es pot situar en un valor inferior a la de la proteïna més llenta coneguda en càrrega negativa neta per a l'interval de pH de treball. El mínim d'este interval està situat aproximadament en 8,0.
• Acrilamida (C₃H₅NO; M_r = 71,08). És un sòlit pulverulento, blanc i cristalí. Quan es troba en dissolució acuosa experimenta autopolimerisació de forma espontànea i llenta; el resultat és que les molècules de acrilamida s'unixen cap en coa. En presència d'un sistema generador de radicals lliures, els monòmers de acrilamida s'activen, quedant ells mateixos en estat de radical lliure, i reaccionen ràpidament per a formar polímeros de cadena llarga. Este tipo de reacció es coneix com polimerisació vinílica. No obstant, l'polímero en dissolució no forma un gel, sino que es troba en estat viscós, degut a que les cadenes poden esgolar unes sobre unes atres. La formació del gel requerix que vàries cadenes queden travades (lo que es conseguix en la bisacrilamida). La acrilamida és una neurotoxina, per lo que deu ser manejada en precaució. També és essencial almagasenar-la en un lloc refrigerat, sec i obscur per a reduir la autopolimerización i la hidrólisis.
• Bisacrilamida, o N,N'-metilenbisacrilamida (C₇H₁₀N₂O₂; M_r = 154,17). La bisacrilamida és l'agent de reticulación més freqüent per als geles de poliacrilamida. La seua estructura està composta per dos molècules de poliacrilamida enllaçades pels seus grups amino, no reactius de cara a la polimerisació. Per això, la bisacrilamida polimeriza conjuntament en la acrilamida pero establix ponts entre les cadenes llineals de poliacrilamida, i aixina evita l'esmonyida d'estes i conduïx a la formació del gel.
• Dodecilsulfato sòdic (SDS) (C₁₂H₂₅NaO₄S; M_r = 288,38). Es tracta de l'agent disociador més habitual per a desnaturalizar proteïnes natives en els seus polipèptits individuals. Quan es calfa breument una mescla de proteïnes a 100 °C en presència de SDS, el detergent recobrix el polipèptit al voltant del seu eix central, mantenint-ho desplegat. En este procés, les càrregues intrínseques del polipèptit són despreciables en comparació per les aportades per el SDS. D'esta manera els polipèptits es transformen despuix del tractament en estructures en forma de bastó que posseïxen una densitat de càrrega uniforme en tota la seua llongitut. La movilitat d'estes proteïnes és una funció aproximadament llineal del logaritmo de la seua massa molecular.
• Persulfato amònic (APS) (N₂H₈S₂O₈; M_r = 228,2). El APS genera radicals lliures i és per això un iniciador de la reacció de polimerisació que finalment forma el gel.
• TEMED, acrònim de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (C₆H₁₆N₂; M_r = 116,21). Es tracta d'un atre iniciador (propagador). La taxa de polimerisació i les propietats del gel resultant depenen de la concentració de APS i TEMED. Aumentant el seu contingut es disminuïx la llongitut mija de la cadena d'polímero i s'incrementa la turbidez del gel, a l'hora que disminuïx la seua elasticitat. En canvi, disminuint la cantitat de iniciadores s'obté l'efecte invers. Es deu, per tant, utilisar la menor concentració possible de catalisadors que permeta la polimerisació en un temps òptim. S'utilisa APS i TEMED en concentracions equimolares de l'orde d'1 a 10 mm.

Reactius per al processament i la visualisació

S'utilisen els següents reactius per al processament del gel i les mostres de proteïnes que es visualisen en ell:

• Blau de bromofenol (BPB, de bromophenol blue) (3',3",5',5"-tetrabromofenolsulfoftaleína) (C19H10Br4O5S; M_r = 669,99). Es tracta del colorant utilisat més freqüentment com a marcador d'alvanç en electroforesis. Les proteïnes i els àcit nucleicos són majorment incoloros. Quan estan somesos a electroforesis és important detindre l'alvanç ans que sobrepassen l'extrem del gel. El blau de bromofenol és el colorant trazador més amprat perque és viable en pH neutre i alcalino, és una molècula menuda, és ionizable i posseïx càrrega negativa a pH superior a 4,6, de modo que migra al ànodo. En ser una molècula menuda s'alvança a la major part de les proteïnes i àcits nucleicos. Quan el experimentador observa que el colorant alcança l'extrem anódico del gel, deu desconectar la corrent i donar per terminada la separació. Es pot unir débilmente a les proteïnes, dotant-les de color blau.
• Glicerol (C3H8O3; M_r = 92,09). Per la seua densitat, contribuïx a que la mostra quede depositada en els pocillos sense dispersar-se.
• Blau de Coomassie (C45H44N3NaO7S2; M_r = 825,97). El CBB (de Coomassie Brilliant Blue, blau lluent de Coomassie) és el colorant per a proteïnes més popular. És de tipo aniónico, i s'unix a proteïnes de modo inespecífico. La seua estructura és predominantment no polar, per lo que habitualment s'usa (al 0,025%) en dissolució en metanol (40%) i acètic (7%). Les proteïnes del gel es fixen gràcies a l'àcit acètic i al mateix temps s'teñir. El colorant en excés que s'incorpora en el gel es pot eliminar destiñendo en una dissolució de composició idèntica llevat pel colorant. Les proteïnes es detecten com a bandes blaves contra un fondo clar. ya que el SDS també és aniónico, pot interferir en el procés d'tinción. Per tant, es recomana un gran volum de dissolució d'tinción, aproximadament dèu voltes el volum del gel.
• Butanol (C4H10O; M_r = 74,12). S'utilisa butanol saturat en aigua com a dissolució de recobriment en el gel de resolució.
• 2-Mercaptoetanol (HS-CH2CH2OH; M_r = 78,13). El 2-mercaptoetanol és un agent reductor que s'utilisa per a trencar els enllaços disulfuro i assegurar-se de que la proteïna està completament desnaturalizada abans de ser carregada en el gel, i d'eixe modo garantisar que corre de manera uniforme.