Anar al contingut

Vector d'expressió

De L'Enciclopèdia, la wikipedia en valencià
Archiu:CAPS 0 8a- CAPS 1 -lacO- CAPS 2 .svg
Un vector d'expressió bacterià per a expressar la proteïna verda fluorescent del promotor T7 .

Un vector d'expressió, també conegut com constructo d'expressió, sol ser un plásmido o virus dissenyat per a la expressió de gens en les cèlules. El vector s'utilisa per a introduir un gen específic en una cèlula diana, i pot comandar el mecanisme de la cèlula per a la síntesis de proteïnes per a produir la proteïna codificada pel gen. Els vectores d'expressió són les ferramentes bàsiques de la biotecnología per a la producció de proteïnes.

El vector està dissenyat per a contindre seqüències reguladores que actuen com a regions potenciadoras i promotores i conduïxen a la transcripció eficient del gen portat en el vector d'expressió.[1] L'objectiu d'un vector d'expressió ben dissenyat és la producció eficient de proteïnes, i açò pot conseguir-se per mig de la producció d'una cantitat significativa de ARN mensager estable, que després pot traduir-se en proteïnes. L'expressió d'una proteïna pot estar estretament controlada, i la proteïna només es produïx en cantitat significativa quan és necessari per mig de l'us d'un inductor; en alguns sistemes, no obstant, la proteïna pot expressar-se de forma constitutiva. La Escherichia coli s'utilisa habitualment com a hoste per a la producció de proteïnes, pero també es poden utilisar atres tipos de cèlules. Un eixemple de l'us del vector d'expressió és la producció d'insulina, que s'utilisa per als tractaments mèdics de la diabetis.

Elements

[editar | editar còdic]

Un vector d'expressió té característiques que pot tindre qualsevol vector, com un orige de replicació, un marcador seleccionable i un lloc adequat per a l'inserció d'un gen com el lloc de clonació múltiple. El gen clonat pot transferir-se d'un vector de clonació especialisat a un vector d'expressió, encara que és possible clonar directament en un vector d'expressió. El procés de clonació es realisa normalment en Escherichia coli. Els vectores utilisats per a la producció de proteïnes en organismes distints de E. coli poden tindre, ademés d'un orige de replicació adequat per a la seua propagació en E. coli, elements que els permeten mantindre's en un atre organisme, i estos vectores es denominen vectores llançadora.

Elements d'expressió

[editar | editar còdic]

Un vector d'expressió deu tindre els elements necessaris per a l'expressió del gen. Estos poden incloure un promotor, la seqüència correcta d'iniciació de la traducció, com un lloc d'unió ribosomal i un codón d'inici, un codón de terminació i una seqüència de terminació de la transcripció.[2] Existixen diferències en la maquinària per a la síntesis de proteïnes entre procariota i eucariota, per lo que els vectores d'expressió deuen tindre els elements d'expressió adequats per a l'hoste elegit. Per eixemple, els vectores d'expressió d'procariota tindrien una seqüència Shine-Dalgarno en el seu lloc d'iniciació de la traducció per a l'unió dels ribosoma, mentres que els vectores d'expressió d'eucariota contindrien la seqüència consens Kozak.


El promotor inicia la transcripció i, per tant, és el punt de control de l'expressió del gen clonat. Els promotors utilisats en el vector d'expressió normalment són inducibles, lo que significa que la síntesis de proteïnes solament s'inicia quan es requerix per mig de l'introducció d'un inductor com IPTG . No obstant, l'expressió gènica també pot ser constitutiva (és dir, la proteïna s'expressa constantment) en alguns vectores d'expressió. Pot produir-se un baix nivell de síntesis de proteïnes constitutives inclús en vectores d'expressió en promotors estrictament controlats.

Etiquetes de proteïnes

[editar | editar còdic]

Despuix de l'expressió del producte gènic, pot ser necessari purificar la proteïna expressada; no obstant, separar la proteïna d'interés de la gran majoria de les proteïnes de la cèlula hoste pot ser un procés prolongat. Per a facilitar este procés de purificació, es pot afegir una etiqueta de purificació al gen clonat. Esta etiqueta pot ser una etiqueta de histidina (His), atres péptidos marcadors o un soci de fusió com la glutatión S-transferasa o la proteïna d'unió a maltosa.[3] Alguns d'estos socis de fusió també poden ajudar a aumentar la solubilidad d'algunes proteïnes expressades. Atres proteïnes de fusió, com la proteïna verda fluorescent, poden actuar com gen informador per a l'identificació de gens clonats en èxit, o poden utilisar-se per a estudiar l'expressió de proteïnes en l'obtenció d'imàgens celulars.[4][5]

Uns atres

[editar | editar còdic]

El vector d'expressió es transforma o transfecta en la cèlula hoste per a la síntesis de proteïnes. Alguns vectores d'expressió poden tindre elements per a la transformació o l'inserció de ADN en el cromosoma de l'hoste, per eixemple, els gens vir per a la transformació de plantes i llocs de integrasa per a l'integració cromosòmica.

Alguns vectores poden incloure una seqüència de direcció que pot dirigir la proteïna expressada a una ubicació específica, com el espai periplásmico de les bactèries.

Sistemes d'expressió / producció

[editar | editar còdic]

Es poden utilisar diferents organismes per a expressar la proteïna objectiu d'un gen, per lo que el vector d'expressió utilisat tindrà elements específics per al seu us en l'organisme concret. L'organisme més utilisat per a la producció de proteïnes és la bactèria Escherichia coli. No obstant, no totes les proteïnes poden expressar-se en èxit en E. coli, o expressar-se en la forma correcta de modificacions postraduccionales, com les glucosilaciones, i per lo tant poden utilisar-se atres sistemes.

Bacterià

[editar | editar còdic]
Archiu:CAPS 21 cloning vector.png
Un eixemple de vector d'expressió bacterià és el plásmido pGEX-3x

L'hoste d'expressió d'elecció per a l'expressió de moltes proteïnes és Escherichia coli, ya que la producció de proteïna heteróloga en E. coli és relativament simple i convenient, ademés de ràpida i barata. També hi ha disponible una gran cantitat de plásmidos d'expressió de E. coli per a una àmplia varietat de necessitats. Atres bactèries utilisades per a la producció de proteïnes són el Bacillus subtilis

La majoria de les proteïnes heterólogas s'expressen en la citoplasma de E. coli. No obstant, no totes les proteïnes formades poden ser solubles en la citoplasma, i les proteïnes incorrectament plegades que es formen en la citoplasma poden formar agregats insolubles cridats cossos d'inclusió. Estes proteïnes insolubles requeriran un nou plegat, lo que pot ser un procés complicat i no necessàriament produir un alt rendiment.[6] Les proteïnes que tenen enllaços disulfuro a sovint no poden plegar-se correctament per l'entorn reductor de la citoplasma, que impedix la formació de dits enllaços, i una possible solució és dirigir la proteïna al espai periplásmico per mig de l'us d'una seqüència senyal N-terminal. Una atra possibilitat és manipular l'entorn redox de la citoplasma.[7] També s'estan desenrollant atres sistemes més sofisticats, que podrien permetre l'expressió de proteïnes que abans es consideraven impossibles en E. coli, com les proteïnes glicosiladas.[8][9][7]


Els promotors utilisats per a estos vectores solen basar-se en el promotor del operón lac o en el promotor T7,[10] i normalment estan regulats per l'operador lac. Estos promotors també poden ser híbrits de diferents promotors, per eixemple, el promotor tac és un híbrit dels promotors trp i lac.[11] Cal tindre en conte que la majoria dels promotors lac o derivats de lac utilisats es basen en el mutante lacUV5, que és insensible a la repressió per catabolitos. Este mutante permet l'expressió de la proteïna baixe el control del promotor lac quan el mig de creiximent conté glucosa, ya que la glucosa inhibiria l'expressió del gen si s'utilisa el promotor lac de tipo salvage.[12] No obstant, la presència de glucosa pot servir per a reduir l'expressió de fondo per mig d'una inhibició residual en alguns sistemes.[13]

Eixemples de vectores d'expressió de E. coli són la série pGEX de vectores a on la glutatión S-transferasa s'usa com a soci de fusió i l'expressió gènica està baix el control del promotor tac,[14][15][16] i la série pET de vectores que utilisen un promotor T7.[17]


És possible expressar simultàneament dos o més proteïnes diferents en E. coli utilisant diferents plásmidos. No obstant, quan s'utilisen dos o més plásmidos, cada u d'ells deu utilisar una selecció d'antibiòtics diferent, aixina com un orige de replicació distint, ya que de lo contrari un dels plásmidos podria no mantindre's de forma estable. Molts dels plásmidos utilisats habitualment es basen en el replicón COLE1 i, per lo tant, són incompatibles entre sí; per a que un plásmido basat en COLE1 coexistixca en un atre en la mateixa cèlula, l'atre tindria que ser d'un replicón diferent, per eixemple, un plásmido basat en el replicón p15A,[18] com la série de plásmidos pACYC. Un atre enfocament seria utilisar un únic vector de dos cistrones o dissenyar les seqüències codificadoras en tàndem com una construcció bi o policistrónica.[19][20]

Rent

[editar | editar còdic]

Un rent comunament utilisat per a la producció de proteïnes és Pichia pastoris.[21] Eixemples de vectores d'expressió de rent en Pichia són la série de vectores pPIC, i estos vectores utilisen el promotor AOX1 que és inducible en metanol.[22] Els plásmidos poden contindre elements per a l'inserció de ADN estrany en el genoma del rent i la seqüència de senyals per a la secreció de la proteïna expressada. Les proteïnes en enllaços disulfuro i glicosilación poden produir-se eficaçment en el rent. Un atre rent utilisat per a la producció de proteïnes és Kluyveromyces lactis i el gen s'expressa, impulsat per una variant del promotor fort de la lactasa LAC4.[23]

Saccharomyces cerevisiae s'utilisa especialment per als estudis d'expressió gènica en el rent, per eixemple en el sistema de dos híbrits de rent per a l'estudi de l'interacció proteïna-proteïna.[24] Els vectores utilisats en el sistema d'hibridació en dos rent contenen socis de fusió per a dos gens clonats que permeten la transcripció d'un gen reporter quan hi ha interacció entre les dos proteïnes expressades a partir dels gens clonats.

Baculovirus

[editar | editar còdic]

En este sistema s'utilisa com a vector d'expressió el baculovirus, un virus en forma de vara que infecta a les cèlules dels insectes.[25] S'utilisen com a hostes llínees celulars d'insectes derivats de lepidòpters (arnes i palometes), com Spodoptera frugiperda. Una llínea celular derivada de la oruga de la col és d'especial interés, ya que s'ha desenrollat per a créixer ràpidament i sense el costós sèrum que normalment es necessita per a impulsar el creiximent celular.[26][27] El vector llançadora es diu bacmid, i l'expressió del gen està baix el control d'un fort promotor pPolh.[28] El baculovirus també s'ha utilisat en llínees celulars de mamífers en el sistema BacMam.[29]

El baculovirus s'usa normalment per a la producció de glicoproteína, encara que les glicosilaciones poden ser diferents de les que es troben en els vertebrats. En general, és més segur d'usar que el virus dels mamífers, ya que té un ranc de hospedadores llimitat i no infecta als vertebrats sense modificacions.

Plantes

[editar | editar còdic]

Molts vectores d'expressió de plantes es basen en el plásmido Tu de Agrobacterium tumefaciens.[30] En estos vectores d'expressió, el ADN que es va a insertar en la planta es clona en el ADN-T, un tram de ADN flanquejat per una seqüència de repetició directa de 25 pb en cada extrem, i que pot integrar-se en el genoma de la planta. El ADN-T també conté el marcador seleccionable. El Agrobacterium proporciona un mecanisme per a la transformació i integració en el genoma de la planta, i els promotors dels seus gens vir també poden utilisar-se per als gens clonats. No obstant, la preocupació per la transferència de material genètic bacterià o víric a la planta ha dut al desenroll de vectores denominats vectores intragénicos, en els que s'utilisen equivalents funcionals del genoma de la planta per a que no hi haja transferència de material genètic d'una espècie forànea a la planta.[31]


Es poden utilisar virus vegetals com vectores, ya que el método de Agrobacterium no funciona per a totes les plantes. Eixemples de virus vegetals utilisats són el virus del mosaic del tabac (VMT), el virus X de la creïlla i el virus del mosaic del caupí.[32] La proteïna pot expressar-se com una fusió en la proteïna de la coberta del virus i es mostra en la superfície de les partícules virals ensambladas, o com una proteïna sense fusionar que s'acumula dins de la planta. L'expressió en la planta utilisant vectores vegetals sol ser constitutiva,[33] i un promotor constitutiu comunament utilisat en els vectores d'expressió vegetal és el promotor 35S del virus del mosaic de la coliflor (CaMV).[34][35]

Mamífers

[editar | editar còdic]

Els vectores d'expressió de mamífers oferixen ventages considerables per a l'expressió de proteïnes de mamífers sobre els sistemes d'expressió bacterians: plegament correcte, modificacions postraduccionales i activitat enzimàtica rellevant. També pot ser més desijable que atres sistemes eucariota no mamífers, en els que les proteïnes expressades poden no contindre les glicosilaciones correctes. Resulta especialment útil per a produir proteïnes associades a la membrana que requerixen chaperonas per al seu correcte plegat i estabilitat i que contenen numeroses modificacions postraduccionales. L'inconvenient, no obstant, és el baix rendiment del producte en comparació als vectores procariota, aixina com la naturalea costosa de les tècniques implicades. La seua complicada tecnologia i la possible contaminació en virus animals d'expressió de cèlules de mamífers també han llimitat el seu us en la producció industrial a gran escala.[36]


Per a la producció de proteïnes poden utilisar-se llínees celulars de mamífers cultivats, com l'ovari d'hàmster chinenc (CHO), COS, i inclús llínees celulars humanes com HEK i HeLa. Els vectores es transfectan en les cèlules i el ADN pot integrar-se en el genoma per recombinació homòloga en el cas de la transfección estable, o les cèlules poden transfectarse transitòriament. Entre els eixemples de vectores d'expressió de mamífers es troben els vectores adenovirales,[37] les séries pSV i pCMV de vectores plasmídicos, els vectores vaccinia i retroviral,[38] aixina com el baculovirus.[29] Els promotors del citomegalovirus (CMV) i del SV40 s'utilisen habitualment en els vectores d'expressió de mamífers per a impulsar l'expressió de gens. També es coneixen promotors no virals, com el promotor del factor d'elongació (EF)-1.[39]

Sistemes sense cèlules

[editar | editar còdic]

En este método in vitro de producció de proteïnes s'utilisa un lisado celular de E. coli que conté els components celulars necessaris per a la transcripció i la traducció. La ventaja d'este sistema és que les proteïnes poden produir-se molt més ràpit que les produïdes in viu, ya que no requerix temps per a cultivar les cèlules, pero també és més car. Els vectores utilisats per a l'expressió de E. coli poden utilisar-se en este sistema, encara que també existixen vectores específicament dissenyats per a este sistema. Els extractes de cèlules eucariota també poden utilisar-se en atres sistemes lliures de cèlules, per eixemple, els sistemes d'expressió lliures de cèlules de germen de blat.[40] També s'han produït sistemes lliures de cèlules de mamífers[41]


Referències

[editar | editar còdic]
  1. ↑ sci.sdsu.edu
  2. ↑ (1994) «Chapter 8: Expression E. coli of cloned DNA molecules», Principles of Gene Manipulation, Blackwell Scientific Publications. ISBN 9780632037124.
  3. ↑ “Overview of Affinity Tags for Protein Purification” . Current Protocols in Protein Science 73 (Unit-9.9): 9.9.1–9.9.23. doi:10.1002/0471140864.ps0909s73. PMID 24510596.
  4. ↑ “Imaging proteins inside cells with fluorescent tags” . Trends in Biotechnology 30 (1): 8–16. doi:10.1016/j.tibtech.2011.08.002. PMID 21924508.
  5. ↑ Erik Snapp. “Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology”. Current Protocols in Cell Biology 27: 21.4.1–21.4.13. doi:10.1002/0471143030.cb2104s27. PMID 18228466.
  6. ↑ Burgess RR (2009). “Refolding solubilized inclusion body proteins”. Methods in Enzymology 463: 259–82. doi:10.1016/S0076-6879(09)63017-2. PMID 19892177.
  7. ↑ 7,0 7,1 “SHuffle, a novell Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm” . Microbial Cell Factories 11. doi:10.1186/1475-2859-11-56. PMID 22569138.
  8. ↑ “Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements” (2012). J Ind Microbiol Biotechnol 39 (3): 383–99. doi:10.1007/s10295-011-1082-9. PMID 22252444.
  9. ↑ “Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges” . Frontiers in Microbiology 5. doi:10.3389/fmicb.2014.00172. PMID 24860555.
  10. ↑ “Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor” (1991). Journal of Molecular Biology 219 (1): 45–59. doi:10.1016/0022-2836(91)90856-2. PMID 1902522.
  11. ↑ deBoer H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983). “The tac promoter: a functional hybrid derived from trp and lac promoters”. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (1): 21–25. doi:10.1073/pnas.80.1.21. PMID 6337371. Bibcode: 1983PNAS...80...21D.
  12. ↑ “Catabolite-insensitive revertants of lac promoter mutants” (1970). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 66 (3): 773–9. doi:10.1073/pnas.66.3.773. PMID 4913210. Bibcode: 1970PNAS...66..773S.
  13. ↑ “Use of glucose to control basal expression in the pET System” . InNovations: 6–7.
  14. ↑ (1988).Gene.67(1)
    31–40.doi:10.1016/0378-1119(88)90005-4.
  15. ↑ «GST Gene Fusion System». Amersham Pharmacia biotech.
  16. ↑ «pGEX Vectors». GE Healthcare Lifesciences. Archivat des d'el original, el 13 de novembre de 2016. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  17. ↑ «pET System manual». Novagen. Archivat des d'el original, el 19 d'agost de 2019. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  18. ↑ E. coli Plasmid Vectors: Methods and Applications (vol. Volume No.: 235), p. 22. ISBN 978-1-58829-151-6.
  19. ↑ “Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli” (1986). Proc Natl Acad Sci O S A 83 (22): 8506–10. doi:10.1073/pnas.83.22.8506. PMID 3534891. Bibcode: 1986PNAS...83.8506S.
  20. ↑ «Cloning Methods - Vaig donar- or multi-cistronic Cloning». EMBL.
  21. ↑ “Recombinant protein expression in Pichia pastoris” (2000). Molecular Biotechnology 16 (1): 23–52. doi:10.1385/MB:16:1:23. PMID 11098467.
  22. ↑ «Pichia pastoris Expression System». Invitrogen. Archivat des d'el original, el 25 de novembre de 2011. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  23. ↑ «K. lactis Protein Expression Kit». New England BioLabs Inc.. Archivat des d'el original, el 4 de març de 2016. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  24. ↑ “A novell genetic system to detect protein-protein interactions” (1989). Nature 340 (6230): 245–6. doi:10.1038/340245a0. PMID 2547163. Bibcode: 1989Natur.340..245F.
  25. ↑ Mckenzie, Samuel (2019-02-26). «The Baculovirus Expression Vector System (BEVS)».
  26. ↑ HINK, W. F.. “Established Insect Cell Line from the Cabbage Looper, Trichoplusia ni” (en). Nature 226 (5244): 466–467. doi:10.1038/226466b0. ISSN 1476-4687. PMID 16057320. Bibcode: 1970Natur.226..466H.
  27. ↑ “Serum-free culture of the suspension cell line QB-Tn9-4s of the cabbage looper, Trichoplusia ni, is highly productive for virus replication and recombinant protein expression” . Journal of Insect Science 14 (1). doi:10.1093/jis/14.1.24. PMID 25373171.
  28. ↑ «Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques». Invitrogen. Archivat des d'el original, el 2 de novembre de 2012. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  29. ↑ 29,0 29,1 (2002).Trends in Biotechnology.20(4)
    173–180.doi:10.1016/S0167-7799(01)01911-4.
  30. ↑ “Techniques in plant molecular biology--progress and problems” (1990). European Journal of Biochemistry 192 (3): 563–76. doi:10.1111/j.1432-1033.1990.tb19262.x. PMID 2209611.
  31. ↑ George Acquaah. Principles of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons Inc. ISBN 9781118313695.
  32. ↑ “Use of viral vectors for vaccine production in plants” (2005). Immunology and Cell Biology 83 (3): 263–270. doi:10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x. PMID 15877604.
  33. ↑ «How Do You Make A Transgenic Plant?». Department of Soil and Crop Sciences at Colorat State University. Archivat des d'el original, el 21 de giner de 2013. Consultat el 14 de setembre de 2021.
  34. ↑ Physiologia Plantarum.79(1)
    154–157.doi:10.1111/j.1399-3054.1990.tb05878.x.
  35. ↑ (1990).Science.250(4983)
    959–66.doi:10.1126/science.250.4983.959.
  36. ↑ Kishwar Hayat Khan (2013). “Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications”. Adv Pharm Bull. 3 (2): 257–263. doi:10.5681/apb.2013.042. PMID 24312845.
  37. ↑ Berkner KL (1992). “Expression of heterologous sequences in adenoviral vectors”. Current Topics in Microbiology and Immunology 158: 39–66. doi:10.1007/978-3-642-75608-5_3. PMID 1582245.
  38. ↑ D I Hruby (1990). “Vaccinia virus vectors: new strategies for producing recombinant vaccines”. Clin Microbiol Rev 3 (2): 153–170. doi:10.1128/cmr.3.2.153. PMID 2187593.
  39. ↑ Kim DW1, Uetsuki T, Kaziro I, Yamaguchi N, Sugano S (1990). “Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system”. Gene 91 (2): 217–23. doi:10.1016/0378-1119(90)90091-5. PMID 2210382.
  40. ↑ (2006) «Chapter 5:Unit 5.18. Wheat Germ Cell-Free Expression System for Protein Production», Current Protocols in Protein Science (vol. Chapter 5), pp. 5.18.1–5.18.18. doi:10.1002/0471140864.ps0518s44. ISBN 9780471140863.
  41. ↑ Brödel AK1, Wüstenhagen DA, Kubick S (2015). «Cell-free protein synthesis systems derived from cultured mammalian cells», Structural Proteomics, pp. 129–40. doi:10.1007/978-1-4939-2230-7_7. ISBN 978-1-4939-2229-1.
Obtingut de «https://www.lenciclopedia.org/w/index.php?title=Vector_d%27expressió&oldid=672594»