Producció de proteïnes
que descriu la transcripció del còdic d'ADN al còdic d'ARN per a les proteïnes en el segon pas que cobrix la producció de proteïnes.]]
La producció de proteïnes és el procés biotecnológico de generar una proteïna específica. Sol conseguir-se per mig de la manipulació de l'expressió gènica en un organisme de manera que expresse grans cantitats d'un gen recombinante. Açò inclou la transcripció del ADN recombinante a ARN mensager (ARNm), la traducció de el ARNm a cadenes polipeptídicas, que finalment es pleguen en proteïnes funcionals i poden dirigir-se a localisacions subcelulares o extracelulares específiques[1]
Els sistemes de producció de proteïnes (en la gerga del laboratori també es denominen "sistemes d'expressió") s'utilisen en les ciències de la vida, la biotecnología i la medicina. L'investigació en biologia molecular utilisa numeroses proteïnes i enzimes, moltes de les quals procedixen de sistemes d'expressió; en particular, l'ADN polimerasa per a la PCR, la transcriptasa inversa per a l'anàlisis de el ARN, les endonucleasas de restricció per a la clonació i per a fabricar proteïnes que s'examinen en el descobriment de fàrmacs com dianes biològiques o com a fàrmacs potencials en sí mateixos. Els sistemes d'expressió també tenen importants aplicacions en la fermentació industrial, sobretot en la producció de productes biofarmacéuticos, com l'insulina humana per a tractar la diabetis, i en la fabricació d'enzimes.
Sistemes de producció de proteïnes
[editar | editar còdic]Els sistemes de producció de proteïnes comunament utilisats inclouen els derivats de bactèries,[2] rent,[3][4] baculovirus / insecte,[5] cèlules de mamífer[6][7] i més recentment foncs filamentosos com Myceliophthora thermophila.[8] Quan es produïxen productes biofarmacéuticos en un d'estos sistemes, les impurees relacionades en el procés denominades proteïnes de la cèlula hoste també apleguen al producte final en cantitats mínimes.[9]
Sistemes basats en cèlules
[editar | editar còdic]Els sistemes d'expressió més antics i més utilisats estan basats en cèlules i poden definir-se com la "combinació d'un vector d'expressió, la seua ADN clonat i l'hoste per al vector que proporcionen un context per a permetre la funció del gen estrany en una cèlula hoste, és dir, produir proteïnes a un alt nivell".[10][11] La sobreexpresión és un nivell anormal i excessivament alt d'expressió gènica que produïx un fenotip pronunciat relacionat en el gen.[12][13]
Hi ha moltes formes d'introduir ADN estrany en una cèlula per a la seua expressió, i es poden usar moltes cèlules hospedadoras diferents per a l'expressió; cada sistema d'expressió té distintes ventages i desventages. Els sistemes d'expressió normalment es denominen pel amfitrió i la font de ADN o el mecanisme d'entrega del material genètic. Per eixemple, els hostes comuns són bactèries (com E. coli, B. subtilis ), rent (com S. cerevisiae[4] ) o llínees celulars eucariota. Les fonts de ADN i els mecanismes d'administració comunes són virus (com baculovirus, retrovirus, adenovirus ), plásmidos, cromosomes artificials i bacteriòfecs (com lambda ). El millor sistema d'expressió depén del gen implicat, per eixemple, a quin es preferix Saccharomyces cerevisiae per a proteïnes que requerixen una modificació postraduccional significativa. S'usen llínees de cèlules d'insectes o mamífers quan es requerix un tall i empalme de ARNm similar a l'humà. No obstant, l'expressió bacteriana té la ventaja de produir fàcilment grans cantitats de proteïna, lo que és necessari per a la cristalografia de rajos X o els experiments de resonància magnètica nuclear per a la determinació de l'estructura.
Ya que les bactèries són procariota, no estan equipades en tota la maquinària enzimàtica per a realisar les modificacions postraduccionales o el plegament molecular necessaris. Per això, les proteïnes eucariota multidominio expressades en bactèries no solen ser funcionals. Ademés, moltes proteïnes es tornen insolubles en forma de cossos d'inclusió que són difícils de recuperar sense desnaturalisants agressius i el consegüent i engorroso replec de la proteïna.
Per a fer front a estos problemes, s'han desenrollat sistemes d'expressió que utilisen múltiples cèlules eucariota per a aplicacions que requerixen que les proteïnes estiguen conformades com en els organismes eucariota o més prop d'ells: les cèlules de plantes (per eixemple, el tabac), d'insectes o de mamífers (per eixemple, els vacuns) es transfectan en gens i es cultiven en suspensió i inclús com a teixits o organismes sancers, per a produir proteïnes completament plegades. No obstant, els sistemes d'expressió in viu de mamífers tenen un baix rendiment i atres llimitacions (temps, toxicitat per a les cèlules hoste, etc.). Per a combinar les característiques d'alt rendiment/productivitat i escalabilidad de les proteïnes de les bactèries i els rent, i les característiques epigenéticas alvançades dels sistemes de plantes, insectes i mamífers, es desenrollen atres sistemes de producció de proteïnes utilisant eucariota unicelulars (és dir, cèlules de "Leishmania" no patógenas).
Sistemes bacterians
[editar | editar còdic]Escherichia coli
[editar | editar còdic].jpg){kind=link}
E. coli és un dels hospedadores d'expressió més utilisats i el ADN normalment s'introduïx en un vector d'expressió plasmídico. Les tècniques per a la sobreexpresión en E. coli estan ben desenrollades i funcionen aumentant el número de còpies del gen o aumentant la força d'unió de la regió promotora per a ajudar a la transcripció.
Per eixemple, una seqüència de ADN per a una proteïna d'interés podria clonar-se o subclonarse en un plásmido d'alt número de còpies que conté el promotor lac (a sovint LacUV5 ), que després es transforma en la bactèria E. coli . L'adició d'IPTG (un anàlec de lactosa ) activa el promotor lac i fa que les bactèries expressen la proteïna d'interés.
Els ceps de E. coli BL21 i BL21 (DE3) són dos ceps comunament utilisades per a la producció de proteïnes. Com a membres del linaje B, carixen de proteasas lon i OmpT, lo que protegix les proteïnes produïdes de la degradació. El profago DE3 que es troba en BL21 (DE3) proporciona la ARN polimerasa de T7 (impulsada pel promotor LacUV5), lo que permet utilisar vectores en el promotor T7 en el seu lloc.[14]
Corynebacterium
[editar | editar còdic]Les espècies no patógenas de Corynebacterium grampositiva s'utilisen per a la producció comercial de varis aminoàcits. L'espècie C. glutamicum s'utilisa àmpliament per a produir glutamato i lisina,[15] components dels aliments humans, els pensos i els productes farmacèutics.
L'expressió del factor de creiximent epidérmico humà funcionalmente actiu s'ha portat a terme en C. glutamicum,[16] demostrant aixina un potencial per a la producció a escala industrial de proteïnes humanes. Les proteïnes expressades poden dirigir-se a la secreció a través de la via secretora general (Sec) o la via d'translocación de arginina bessona (Tat).[17]
A diferència de les bactèries gramnegativas, la Corynebacterium grampositiva carix de lipopolisacáridos que funcionen com endotoxines antigénicas en humans.
Pseudomonas fluorescens
[editar | editar còdic]La bactèria no patógena i gramnegativa Pseudomonas fluorescens s'utilisa per a la producció d'alt nivell de proteïnes recombinantes, normalment per al desenroll de bioterapias i vacunes. P. fluorescens és un organisme metabólicamente versàtil, que permet l'erejat d'alt rendiment i el ràpit desenroll de proteïnes complexes. P. fluorescens és més conegut per la seua capacitat de produir ràpidament i en èxit alts títuls de proteïnes actives i solubles.[18]
Sistemes eucariota
[editar | editar còdic]Rent
[editar | editar còdic]Els sistemes d'expressió que utilisen S. cerevisiae o Pichia pastoris permeten la producció estable i duradora de proteïnes que es processen de manera similar a les cèlules de mamífers, en alt rendiment, en mijos de proteïnes químicament definits.
Foncs filamentosos
[editar | editar còdic]Els foncs filamentosos, especialment Aspergillus i Trichoderma, pero també més recentment Myceliophthora thermophila C1[8] s'han desenrollat en plataformes d'expressió per a la detecció i producció de diverses enzimes industrials . El sistema d'expressió C1 mostra una morfologia de baixa viscosidad en cultiu sumergit, lo que permet l'us de mijos complexos de creiximent i producció.
Cèlules infectades en baculovirus
[editar | editar còdic]Les cèlules d'insecte infectades per baculovirus[19] (ceps Sf9, Sf21, High Five) o les cèlules de mamífer[20] (HeLa, HEK 293) permeten la producció de proteïnes glicosiladas o de membrana que no poden produir-se per mig de sistemes fúngicos o bacterians.[19] És útil per a la producció de proteïnes en gran cantitat. Els gens no s'expressen contínuament perque les cèlules hoste infectades acaben lisándose i morint durant cada cicle d'infecció.[21]
Expressió de cèlules d'insectes no líticas
[editar | editar còdic]L'expressió no lítica en cèlules d'insecte és una alternativa al sistema d'expressió lítica per baculovirus. En l'expressió no lítica, els vectores es transfectan de forma transitòria o estable en el ADN cromosòmic de les cèlules d'insecte per a la posterior expressió gènica.[22][23] A continuació, es realisa la selecció i l'erejat dels clons recombinantes.[24] El sistema no lítico s'ha utilisat per a obtindre un major rendiment proteic i una expressió més ràpida dels gens recombinantes en comparació a l'expressió de cèlules infectades per baculovirus.[23] Les llínees celulars utilisades per a este sistema inclouen: Sf9, Sf21 de cèlules de Spodoptera frugiperda, Hi-5 de cèlules de Trichoplusia ni i cèlules de Schneider 2 i cèlules de Schneider 3 de cèlules de Drosophila melanogaster.[22][24] En este sistema, les cèlules no es lisan i es poden utilisar varis modos de cultiu.[22] Ademés, les séries de producció de proteïnes són reproduibles.[22][23] Este sistema dona un producte homogéneu.[23] Un inconvenient d'este sistema és el requisit d'un pas d'erejat adicional per a seleccionar clones viables.[24]
Els sistemes d'expressió de Leishmania tarentolae (no pot infectar als mamífers) permeten la producció estable i duradora de proteïnes en alt rendiment, en mijos químicament definits. Les proteïnes produïdes exhibixen modificacions postraduccionales completament eucariota, inclosa la glicosilación i la formació d'enllaços disulfuro.
Sistemes de mamífers
[editar | editar còdic]Els sistemes d'expressió de mamífers més comuns són les cèlules d'ovari de hàmster chinenc (CHO) i de renyó embrionari humà (HEK).[25][26][27]
- Cèlula d'ovari d'hàmster chinenc[26]
- Mieloma linfoblástico de rata (p. eix. cèlula NS0)[25]
- Completament humà
Sistemes sense cèlules
[editar | editar còdic]La producció de proteïnes sense cèlules es realisa in vitro utilisant ARN polimerasa, ribosoma, ARNt i ribonucleótidos purificats. Estos reactius poden produir-se per extracció de cèlules o a partir d'un sistema d'expressió celular. Pels baixos nivells d'expressió i a l'elevat cost dels sistemes lliures de cèlules, els sistemes basats en cèlules són més utilisats[28]
Atres llectures
[editar | editar còdic]- Higgins, Steve J.; Hames, B. D. (1999). Protein Expression: A Practical Approach, Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963623-5.
- Baneyx, François (2004). Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, Garland Science. ISBN 978-0-9545232-5-1.
Referències
[editar | editar còdic]- ↑ Nature Methods.5(2)
- 135–46.doi:10.1038/nmeth.f.202.
- ↑ Current Opinion in Biotechnology.10(5)
- 411–21.doi:10.1016/s0958-1669(99)00003-8.
- ↑ Molecular Biotechnology.16(1)
- 23–52.doi:10.1385/MB:16:1:23.
- ↑ 4,0 4,1 (2011) «Protein production in Saccharomyces cerevisiae for systems biology studies», Methods in Systems Biology, pp. 197–212. doi:10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6. ISBN 9780123851185.
- ↑ Nature Biotechnology.23(5)
- 567–75.doi:10.1038/nbt1095.
- ↑ Protein Expression and Purification.40(2)
- 237–43.doi:10.1016/j.pep.2004.07.015.
- ↑ Analytical Biochemistry.380(1)
- 146–8.doi:10.1016/j.ab.2008.05.020.
- ↑ 8,0 8,1 Industrial Biotechnology.7(3)
- 214–223.doi:10.1089/ind.2011.7.214.
- ↑ Biotechnology and Bioengineering.103(3)
- 446–458.ISSN 0006-3592.doi:10.1002/bit.22304.
- ↑ «Definition: expression system». Online Medical Dictionary. Centre for Cancer Education, University of Newcastle upon Tyne: Cancerweb. Consultat el 2008-06-10.
- ↑ «Expression system - definition». Biology Online. Biology-Online.org. Consultat el 2008-06-10.
- ↑ «overexpression». Oxford Living Dictionary. Oxford University Press. Archivat des d'el original, el 20 d'octubre de 2018. Consultat el 18 May 2017. «The production of abnormally large amounts of a substance which is coded for by a particular gene or group of gens; the appearance in the phenotype to an abnormally high degree of a character or effect attributed to a particular gene.»
- ↑ «overexpress». National Cancer Institute at the National Institutes of Health. «overexpress
In biology, to make too many copies of a protein or other substance. Overexpression of certain proteins or other substances may play a role in cancer development.» - ↑ Journal of Molecular Biology.394(4)
- 644–52.doi:10.1016/j.jmb.2009.09.052.
- ↑ “The transcriptional regulatory repertoire of Corynebacterium glutamicum: reconstruction of the network controlling pathways involved in lysine and glutamate production” . Journal of Biotechnology 149 (3): 173–82. doi:. PMID 19963020.
- ↑ “Secretion of human epidermal growth factor by Corynebacterium glutamicum” . Letters in Applied Microbiology 42 (1): 66–70. doi:. PMID 16411922.
- ↑ Applied Microbiology and Biotechnology.76(3)
- 633–42.doi:10.1007/s00253-007-0934-8.
- ↑ Protein Expression and Purification.81(2)
- 157–65.doi:10.1016/j.pep.2011.09.010.
- ↑ 19,0 19,1 “Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins” . Glycoconjugate Journal 16 (2): 109–23. doi:. PMID 10612411.
- ↑ “Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells” . Current Opinion in Biotechnology 10 (5): 428–33. doi:. PMID 10508635.
- ↑ Journal of Biotechnology.127(3)
- 335–47.doi:10.1016/j.jbiotec.2006.07.012.
- ↑ 22,0 22,1 22,2 22,3 “Optimising the drosophila S2 expression system for production of therapeutic vaccines” (2011). BioProcessing Journal 10 (2): 28–35. doi:.
- ↑ 23,0 23,1 23,2 23,3 “Comparison of different signal peptides for protein secretion in nonlytic insect cell system” . Analytical Biochemistry 359 (1): 45–53. doi:. PMID 17046707.
- ↑ 24,0 24,1 24,2 “Stable insect cell cultures for recombinant protein production” . Current Opinion in Biotechnology 8 (5): 590–4. doi:. PMID 9353223.
- ↑ 25,0 25,1 Biotechnology Advances.30(5)
- 1158–70.doi:10.1016/j.biotechadv.2011.08.022.
- ↑ 26,0 26,1 26,2 26,3 Current Opinion in Structural Biology.26
- 39–43.doi:10.1016/j.sbi.2014.03.006.
- ↑ Current Opinion in Structural Biology.38
- 129–36.doi:10.1016/j.sbi.2016.06.005.
- ↑ FEBS Letters.588(2)
- 261–8.doi:10.1016/j.febslet.2013.10.016.
- Este artícul conté una traducció derivada de «Producción de proteínas» de Wikipedia en castellà publicada baix la Llicència de documentació lliure de GNU i la Llicència Creative Commons Reconeiximent-CompartirIgual 4.0 Internacional.