Cromatografía d'afinitat

La cromatografía d'afinitat és una tècnica de separació d'una solució que utilisa la propietat dels seus components per a unir-se a determinades molèculas. De forma general, consistix en fer passar la mescla a través d'un mig sòlit en el qual quedarà unit un component per mig d'enllaços covalente. Les seues tècniques principals són la «inmunoafinidad», la «afinitat metàlica» i la «pseudoafinidad». Va ser concebuda i desenrollada per primera volta per Pedro Cuatrecasas i Meir Wilchek en 1968, com una forna de purificar proteïnes.

Principis

Es fa passar una solució per una columna que conté un substrat (blau) i un lligant (vert), conseguint que alguna substància en concret (roja) es adherixca al lligant i se separe del restant (groc), que fluïx sense reaccionar

La cromatografía d'afinitat es tracta de separar components d'una mescla que continga biomoléculas. Per a això es prepara un substrat sòlit que continga un lligant unit per mig d'enllaços covalente, en la capacitat de reaccionar en alguna molècula objectiu. La solució es fa fluir a través del sòlit i la molècula objectiu se separa del restant. El substrat ideal és aquell que millor mantinga immovilisat al lligant. Com, per eixemple, acrilatos o geles de sílice. Per a recuperar la substància purificada es pot variar alguna propietat del lligant, com pot ser el seu pH o el seu concentració, o s'afig alguna substància en major reactivitat que la molècula objectiu. En qualsevol cas, la substància purificada precipita i es pot recuperar. Per a evitar que el lligant reaccione en qualsevol component de la mescla se sol afegir un inhibidor, conegut com a «espayador». L'inhibidor més utilisat és alguna cadena hidrocarbonada.

Alguns eixemples d'interaccions que poden utilisar-se són:

• Antígeno – anticòs.
• Enzima – substrat.
• Receptor – lligant.
• Lectina – carbohidrat.
• Proteïna – àcit nucleico.

Usos

Té un camp d'aplicació molt ampli, ya que permet treballar en proteïnes, àcits nucleicos, hormonas, enzimas i moltes atres biomoléculas. Entre les principals aplicacions destaquen la biotecnología, la biofarmacéutica, la investigació científica el diagnòstic mèdic, la indústria alimentària i la evaluació d'impacte ambiental. Etiquetar proteïnes pot reduir temps i costs, ya siga des d'un proyecte d'investigació fins a usos industrials a gran escala. Lo que ho torna una opció més a considerar en aplicar esta tècnica.

Inmunoafinidad

Us d'anticossos per a purificar molècules

Esta tècnica utilisa un anticòs que es fixa a una matriu per a aïllar una proteïna d'una mescla complexa. Els anticossos són proteïnes que s'unixen fermament a les seues antígenos. Els vertebrats la produïxen com un mig de defensa contra les infeccions. Cada animal pot fabricar mils de millons de molècules d'anticossos diferents. Cada anticòs reconeix el seu antígeno en gran especificidad. Justament esta propietat és fonamental en l'utilisació d'esta tècnica.

El procediment pot separar-se en els següents passos:

1. Hi ha una columna en anticossos anti-A.
2. Es adicionan les molècules antígeno-A, i les no desijades.
3. Eluyen les molècules no desijades quedant les antígeno-A en els anticossos, més una miqueta de molècules no desijades.
4. Es llava la columna i queden solament els anticossos més la seua molècula antígeno-A.
5. Finalment eluye la molècula antígeno-A(que en este cas es volia separar).

Un soport o matriu és la fase sòlida a la que el anticòs és adherit i generalment per a donar-los este us es troben activats, és dir que estan proveïts d'un braç espayador el qual és conseguit per una reacció química en la que s'induïx en la matriu certs grups funcionals altament reactius, lo que ajudara un millor anclaje a l'anticòs. La matriu més usada per a l'unió d'un anticòs és la agarosa el nom comercial de la qual és Sepharosa, pero també es coneixen atres matrius de distinta naturalea a les quals se li poden unir anticossos, i poden dividir-se depenent l'utilitat que se'ls desige donar:

1. Materials inorgànics: vidre, sílica, acer, arena.
2. Polímero orgànics sintètics generalment hidrofòbics: poliestireno.
3. Polímero orgànics naturals principalment hidrofílicos: agarosa, celulosa, almidó.

Indústria farmacèutica

Columna utilisada en el procés de purificació de proteïnes que contenen una etiqueta de histidina, utilisant un substrat de níquel-agarosa

En la indústria farmacèutica s'utilisa esta tècnica en la producció i purificació de proteïnes recombinantes, en l'obtenció d'hormones com la insulina o la eritropoyetina, i en el desenroll de vacunas i anticossos monoclonales. Aixina mateix, s'utilisa en freqüència la tècnica d'etiquetage, que consistix en afegir a la proteïna objectiu un péptido en un dels seus extrems per a facilitar l'unió en el ligante. No obstant açò presenta certes dificultats, ya que es deu proporcionar suficient rendiment i alta purea per al producte final, preservant al mateix temps la seua estructura i funcionalitat. Encara que la varietat d'etiquetes disponibles permet utilisar-les en més que solament la purificació, sent útils en moltes característiques bioquímicas i analítiques o podent actuar com potenciadores de la solubilidad, entre atres propietats útils per al procés d'cromatografía.

Les etiquetes més utilisades inclouen la histidina (His), el glutatión S-transferasa (GST), la proteïna d'unió a maltosa (MBP) i la variant CL7 de la colicina E7. Les etiquetes de histidina tenen afinitat pels ionés de níquel, cobalt, zinc, coure i ferro que han segut immovilisats formant enllaços covalente coordinats en un agent quelante incorporat en la fase estacionaria. Per a la elución s'utilisa una cantitat en excés d'un compost capaç d'actuar com lligant de ions metàlics, com el imidazol. Posteriorment, s'aplica una proteasa activa i específica que llibera la proteïna de la seua etiqueta.

Existix una tècnica coneguda com a «cromatografía d'afinitat dèbil» que consistix en caracterisar interaccions biològiques dèbils o transitòries, per a després separar i purificar un analito per al seu estudi. Que, combinat en espectrometria de masses, permet detectar casi qualsevol substància, inclús en mescles complexes. S'utilisa tant en diagnòstic com en el desenroll de fàrmacs.