Difracció Anómala Múltiple

Es coneix com MAD (Multiwavelength Anomalous Dispersion/Diffraction o Dispersió/Difracció Anómala Múltiple) a una tècnica cristalográfica empleada per a determinar l'estructura de molècules. Es basa en les chicotetes diferències en l'intensitat de la difracció causades pel fenomen de la dispersió anómala o absorció dels rajos X per certs àtoms presents en la molècula. S'utilisa principalment per a determinar l'estructura d'macromolécula, com les proteïnes. L'us de sincrotronés com a fonts de rajos X i el desenroll teòric i experimental, portat a terme per Jerome Karle i Wayne Hendrickson entre uns atres, varen resultar en una notable expansió del método a finals de el XX.

Desenroll del método

El físic suec Ivar Waller va ser el primer en predir teòricament la dispersió per rajos X en 1928 i en 1933 l'alemà Helmut Höln va proporcionar els primers càlculs de la magnitut de l'efecte. Dos décades més tart, Johannes Bijvoet es percató de que este efecte possibilitava identificar l'enantiómero correcte de l'estructura del tartrato de sodi-rubidi i en 1954 va predir que el método podria utilisar-se per a resoldre estructures de novo sense cap tipo d'informació prèvia.

En 1956, Okaya i Pepinsky varen propondre explotar la variació de la dispersió en la llongitut d'ona i Jerome Karle va introduir en 1967 un anàlisis algebraic del método per a determinar l'estructura a partir de la dispersió anómala a diferents llongituts d'ona; este anàlisis va ser refinat en 1980; llavors, s'estaven començant a habilitar sincrotronés com a fonts de rajos X. A diferència dels tubos de rajos X, que emeten radiació monocromàtica, la radiació sincrotrón conta en un ampli espectre i és senzill seleccionar les llongituts d'ona específiques a on s'observen extrems de dispersió anómala. Phillips i els seus colaboradors varen reconéixer el potencial per a la solució d'estructures d'macromolécula i Wayne Hendrickson va realisar aportes claus a la tècnica, incloent l'adopció d'un protocol per a substituir l'aminoàcit metionina en proteïnes recombinantes per seleniometionina; els àtoms de seleni exhibixen una dispersió anómala fàcilment detectable a les llongituts d'ona obtenibles en llínees de llum sincrotrón. Gràcies a estos alvanços la dispersió anómala múltiple ha aplegat a ser un dels métodos més amprats per a elucidar noves estructures d'macromolécula.

Fonaments teòrics

Archiu:Anomalous structure factor.svg

Efecte del factor anómal de forma: El vector FH és la contribució al factor d'estructura d'un àtom pesat a una llongitut d'ona en dispersió anómala baixa. El vector FHA és el factor d'estructura per a la mateixa reflexió prop d'un bot d'absorció a on les magnitut de l'efecte anómal és major. La component imaginària del factor anómal causa un canvi de fase, i abdós components alteren l'amplitut (igual al mòdul del vector) del factor d'estructura.

El método MAD, de la mateixa manera que el método relacionat SAD, es basa en les diferències en intensitat dels rajos X reflectits per un cristal a raïl del fenomen de la dispersió anómala.

Archiu:Anomalous Friedel pairs.svg

L'amplitut dels parells Friedel FT i FT- no és igual en la presència d'absorció per un àtom o grup d'àtoms en la molècula, la contribució de la qual no anómala al factor d'estructura està representada per FH. En canvi, en l'absència d'absorció (f" ≈ 0), l'amplitut de FPH i FPH és igual.

Dispersió anómala

Quan l'energia —inversamente proporcional a la llongitut d'ona— dels rajos X incidents en un material és diferent a l'energia que manté als electronés lligats al núcleu, dits electrons interactuen en el camp electromagnètic com a electrons lliures; la dispersió elàstica conjunta de tots els electrons de l'àtom, quantificada pel factor de forma atòmica elàstic $f_0$, dona lloc a la difracció cristalina. La dispersió anómala ocorre quan l'energia dels rajos X és similar a l'energia de lligam dels electrons en un determinat nivell atòmic; en este cas, els electrons entren en resonància en el camp electromagnètic, oscilant en fase en est. Dits electrons poden ademés absorbir energia dels rajos X i alcançar un nivell d'energia atòmic superior; estes discontinuïtats en les propietats d'absorció de l'àtom a les energies dels nivells atòmics es coneixen com a bots d'absorció.

La dispersió anómala es descriu matemàticament per un número complejo, el factor atòmic anómal: $f_a=f^{\prime }+i{f}^{″}$. La part real $f^{\prime }$ es coneix com a terme dispersivo, i la part imaginària $f^{″}$, com a terme d'absorció.$f^{\prime }$ i $f^{″}$ estan relacionades per les equacions de Kramers-Kronig.

A diferència de la component elàstica $f_0$, el factor de dispersió anómal experimenta una important variació en a l'energia del camp electromagnètic en la proximitat d'un bot d'absorció atòmic. El factor de forma atòmica total $f$ és la suma del terme elàstic i el terme anómal:

$f=f_0+f^{\prime }+i{f}^{″}$

Determinació de l'estructura

La component anómala del factor de forma atòmic introduïx una diferència en el factor d'estructura cristalí $𝐅$ per a una reflexió medida a dos llongituts d'ona diferents. Ademés la part imaginària del factor de forma $f^{″}$ causa també una diferència en la magnitut del factor d'estructura per a la reflexions relacionades per un centre o pla de simetria de la ret recíproca. Estes diferències són normalment chicotetes en cristals de materials orgànics, com les proteïnas o àcits nucleicos, puix els bots d'absorció dels àtoms conformante ocorren a llongituts d'ona molt majors —és dir, menor energia— que la dels rajos X empleats per a estudiar els cristals. L'efecte és molt més detectable en quan les molècules orgàniques contenen metals o atres àtoms pesats, puix l'energia de lligam dels electrons aumenta en el número atómico. Els àtoms pesats poden estar presents naturalment o ser incorporats a la molècula per mig de tècniques químiques o biològiques; entre estes, la més freqüentment empleada és la substitució dels àtoms de sofre en l'aminoàcit metionina per seleni, en paregudes propietats químiques pero en un bot d'absorció a una energia de 12,6 keV, propicia per als experiments cristalográficos. En la presència de tals àtoms pesats, el factor d'estructura total es pot expressar com la suma del factor d'estructura corresponents a tots els àtoms llaugers ${𝐅}_P$, i els àtoms pesats ${𝐅}_H$, més la contribució anómala d'estos, dependent de la llongitut d'ona ${𝐟}_A(\lambda )$:

$𝐅={𝐅}_P+{𝐅}_H+{𝐟}_A(\lambda )={𝐅}_{PH}+{𝐟}_A(\lambda )$

En el cas més simple en que tots els àtoms en dispersió anómala siguen del mateix tipo, l'intensitat de la reflexió es pot expressar com:

$|𝐅{|}^2=|{𝐅}_{PH}{|}^2+\frac{f{\text{'}}^2+f^{\prime }{\text{'}}^2}{f_0^2}|{𝐟}_A{|}^2+2\frac{f^{\prime }}{f_0}|{𝐅}_{PH}||{𝐟}_A|\cos (\alpha -{\alpha }_A)+2\frac{f^{″}}{f_0}|{𝐅}_{PH}||{𝐟}_A|\sin (\alpha -{\alpha }_A)$

Com les amplitutés dels parells Friedel $|{𝐅}^{+}|$ de $|{𝐅}^{-}|$ no són equivalents en la presència de dispersió anómala, a cada llongitut d'ona s'obtenen dos equacions diferents per a cada reflexió; a dos llongituts d'ona es poden determinar, en principi, les tres cantitats desconegudes $|{𝐅}_{PH}|$, $|{𝐟}_A|$ i $\alpha -{\alpha }_A$. Quan les diferències dispersivas i anómales són lo suficientment grans, les posicions dels àtoms de seleni o un atre àtom pesat es poden calcular per métodos directes o síntesis de Patterson, lo que a la seua volta permet obtindre la fase per a la contribució anómala ${\alpha }_A$ i, seguidament la fase total $\alpha$. Una volta coneguts tant les amplitut com les fases del factor d'estructura, s'usa la transformada ràpida de Fourier per a calcular un mapa de densitat electrònica que mostra la posició dels àtoms de la molècula.