Polimerasa Taq

Archiu:Taq.png

Polimerasa Taq

La polimerasa Taq és un tipo d'ADN polimerasa termoestable, nomenada d'esta forma degut a que és produïda per la bactèria Thermus aquaticus (T-aq) i a partir de la qual va ser aïllada en 1968 per Thomas D. Brock. A sovint sol abreviar-se com "Taq Pol" (o simplement com "Taq"), i s'utilisa en freqüència en les tècniques de PCR, tècnica aplicada per a amplificar seqüències curtes d'ADN.^{cita requerida}

T. aquaticus és una bactèria que viu en manantiales calentes i fonts hidrotermales, i la polimerasa Taq que d'ella s'extrau s'ha caracterisat com una extremoenzima capaç de soportar les condicions d'alta temperatura requerides durant el procés de PCR sense desnaturalizarse. Per esta raó, ha reemplaçat a la ADN polimerasa provinent de E. coli (Eco pol) que era la que originalment s'utilisava en esta tècnica, pero que requeria ser reemplaçada després de cada cicle de calfament aumentant les provabilitats de contaminació i prolongant els temps. La temperatura òptima de funcionament de la Taq és de 75 °C-80 °C, en una semivida major a les dos hores a 92,5 °C, 40 minuts a 95 °C i 9 minuts a 97,5 °C. Esta enzima pot replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en menys de 10 segons funcionant a 72 °C de temperatura.

Un dels inconvenients de la Taq és la seua relativament baixa fidelitat. Carix d'activitat correctora d'errors 3'→5' exonucleasa, i posseïx una taxa d'introducció d'errors d'aproximadament 1 cada 9000 nucleòtits. No obstant els dos dominis restants poden actuar en coordinació per mig del moviment acoplat de dominis. S'han aïllat algunes atres polimerasa de ADN d'atres bactèries termofílicas i estoves, tals com la polimerasa Pfu (aïllada de Pyrococcus furiosus) que sí posseïxen activitat correctora d'errors; estes polimerasa s'utilisen soles o combinades en la Taq quan es requerix un amplificament d'alta fidelitat.

La polimerasa Taq produïx ADNs que posseïxen una adenina terminal no apareada penjant del seu extrem 3'. Açò pot resultar útil en tècniques de clonació TA, a on un vector de clonació (tal com per eixemple un plásmido) que posseïx una timina 3' sobreixent pot ser utilisat per a complementar l'adenina sobreixent del producte de la PCR, permetent d'esta forma lligar el producte de PCR dins del vector plásmido.

La polimerasa Taq en PCR

En els primers anys de la década de 1980 Kary Mullis es trobava treballant en la Cetus Corporation sobre el tema de l'aplicació de formes sintètiques de ADN a la biotecnología. Estava familiarizado en l'us d'oligonucleótidos de ADN com sondes capaces d'unir-se a determinades cadenes de ADN que contingueren una seqüència específica de nucleòtits; també en l'us d'estes sondes com iniciadores per a la seqüenciació de ADN i síntesis d'ADN complementari. En 1983 va començar a utilisar una tècnica que consistia en agregar dos iniciadores, un para hibridar en cada una de les cadenes de ADN, i després afegir una polimerasa de ADN al mig de reacció. Açò produïa una replicació exponencial de el ADN incrementant de manera sorprenent la seqüència de ADN continguda entre els dos iniciadores.

No obstant, després de cada ronda de replicació la mescla devia ser calfada per damunt dels 90 °C para desnaturalizar la doble cadena de ADN recent formada, permetent d'esta manera que cada una de les cadenes simples poguera servir com a plantilla per a la següent ronda d'amplificament. Este pas de calfament també inactivaba la ADN polimerasa (el fragment de Klenow de l'ADN polimerasa I provinent d'E. coli) que s'utilisava abans del descobriment de la polimerasa Taq.

L'utilisació de la polimerasa Taq termoestable elimina la necessitat d'afegir noves cantitats de polimerasa durant el procés de termociclado. D'esta forma és possible utilisar un únic tubo tancat en una màquina de termociclado relativament simple per a realisar tot el procés. Per lo tant, l'us de la polimerasa Taq va ser l'idea clau que va permetre fer aplicable el procés de PCR a una gran varietat de problemes de biologia molecular relacionats en l'anàlisis de ADN.

Inconvenients en les paleses

La companyia farmacèutica Hoffmann-La Roche finalment va comprar a Cetus les palesas sobre la Taq i la tècnica de PCR per 330 millons de dólars; es calcula que ha rebut més de 2000 millons de dólars en regalías per la possessió de tals paleses. En 1989, Science va nomenar a la polimerasa Taq com el seu primer "Molècula de l'Any". Kary Mullis va rebre el Premi Nobel de Química en 1993, sent l'únic guardonat per l'investigació portada a terme en la companyia de biotecnología. Cap als primers anys de la década de 1990, la tècnica de PCR en la polimerasa Taq ya s'estava utilisant en numeroses àrees, incloent investigació bàsica en biologia molecular, ensajos genètics clínics, i en ciència forense. També va començar a trobar una important aplicació en la detecció directa del virus VIH en el Síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

En decembre de 1999, el Juge de Districte de EE. UU. Vaughn Walker va dictaminar que la palesa de 1990 que involucrava a la polimerasa Taq es trobava afectada, en part, per informació malintencionada i falsos reclams de part dels científics de la Cetus Corporation. El dictamen va donar lloc a una demanda de la companyia Promega Corporation contra Hoffmann-La Roche els qui varen comprar les paleses de la Taq en 1991. El juge Walker va citar varis descobriments previs d'atres laboratoris, incloent el laboratori del professor John Trela en el Departament de Ciències Biològiques de l'Universitat de Cincinnati, com a base per al seu dictamen.