Precipitació en etanol

La precipitació en etanol és un método utilisat per a purificar i/o concentrar l'ARN, l'ADN i els polisacàrits com la pectina i el xiloglucano a partir de solucions acuosas afegint etanol com antisolvente.

Precipitació de ADN

Teoria

Archiu:Na+ caps block 3 .svg

La primera esfera de solvatación d'un ion de sodi dissolt en aigua.

El ADN és polar pel seu esquelet de fosfat altament carregada. El seu polaridad ho fa soluble en aigua (l'aigua és polar) segons el principi "lo semblant dissol lo semblant".

Per l'alta polaridad de l'aigua, ilustrada per la seua elevada constant dielèctrica de 80,1 (a 20 °C), les forces electrostàtiques entre les partícules carregades són considerablement menors en una solució acuosa que en el buit o en l'aire.

Esta relació es reflectix en la llei de Coulomb, que pot utilisar-se per a calcular la força que actua sobre dos càrregues $q_1$ i $q_2$ separats per una distància $r$ utilisant la constant dielèctrica ${\epsilon }_r$ (també cridada permitividad estàtica relativa) del mig en el denominador de l'equació (${\epsilon }_0$ és la permitividad del buit):

$F=\frac{1}{4\pi {\epsilon }_r{\epsilon }_0}\frac{q_1{q}_2}{r^2}$

A nivell atòmic, la reducció de la força que actua sobre una càrrega es deu a que les molècules d'aigua formen una esfera de solvatación a la seua entorn. Este fet fa que l'aigua siga un molt bon dissolvent per a composts carregats com les sals. La força elèctrica que normalment manté units els cristals de sal per mig d'enllaços iònics es debilita en presència de l'aigua, lo que permet que els ions se separen del cristal i es propaguen per la solució.

El mateix mecanisme opera en el cas dels grups de fosfat carregats negativament en l'esquelet de el ADN: encara que els ions positius estan presents en la solució, la força electrostàtica neta relativament dèbil els impedix formar enllaços iònics estables en els fosfat i precipitar-se fora de la solució.

l'etanol és molt manco polar que l'aigua, en una constant dielèctrica de 24,3 (a 25 °C). Açò significa que l'adició d'etanol a la solució interromp l'erejat de càrregues per part de l'aigua. Si s'afig suficient etanol, l'atracció elèctrica entre els grups fosfat i els ions positius presents en la solució es torna lo suficientment forta com per a formar enllaços iònics estables i la precipitació de el ADN. Açò sol ocórrer quan l'etanol compon més del 64% de la solució. Com sugerix el mecanisme, la solució té que contindre ions positius per a que es produïxca la precipitació; normalment Na⁺, NH₄⁺ o Li⁺ eixerciten este paper .

Pràctica

Una centrifugador de taula de laboratori

El ADN es precipita assegurant-se primer de que la concentració correcta de ions positius està present en la solució (un excés donarà lloc a una gran cantitat de sal que co-precipite en el ADN, i un defecte donarà lloc a una recuperació incompleta de el ADN) i després afegint dos o tres volums d'etanol a lo manco al 95%. Molts protocols aconsellen almagasenar el ADN a baixa temperatura en este punt, pero també s'ha observat que pot no millorar la recuperació de el ADN, i inclús pot disminuir l'eficàcia de la precipitació si s'utilisa el temps d'incubació nocturn. Per lo tant, es pot conseguir una bona eficàcia a temperatura ambiente, pero si es té en conte la possible degradació, provablement siga millor incubar el ADN en gèl humit. El temps d'incubació òptim depén de la llongitut i la concentració de el ADN. Els fragments més menuts i les concentracions més baixes requeriran temps més llarcs per a conseguir una recuperació acceptable. Per a llongituts molt chicotetes i concentracions baixes es recomana l'incubació nocturna. En estos casos, l'us de portadors com l'ARNt, el glucógeno o la poliacrilamida llineal poden millorar molt la recuperació.

Durant l'incubació, el ADN i algunes sals es precipitaran de la solució; en el següent pas, este precipitat s'arreplega per centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altes velocitats (12.000g). El temps i la velocitat d'centrifugación tenen el major efecte en les taxes de recuperació de ADN. De nou, els fragments més menuts i les dilució més altes requerixen una centrifugación més llarga i ràpida. La centrifugación pot realisar-se tant a temperatura ambiente com a 4 °C o 0 °C. Durant la centrifugación, el ADN precipitat té que desplaçar-se a través de la solució d'etanol fins al fondo del tubo, les temperatures més baixes aumenten la viscosidad de la solució i els volums més grans fan que la distància siga més llarga, per lo que abdós factors disminuïxen l'eficiència d'este procés que requerix una centrifugación més llarga per al mateix efecte.

Despuix de la centrifugación, s'elimina la solució sobrenadante, deixant un pellet de ADN cru. El fet de que el pellet siga visible depén de la cantitat de ADN i de la seua purea (els pellets més bruts són més fàcils de vore) o de l'us de co-precipitantes.

En el següent pas, s'afig etanol al 70% al pellet, i es mescla suaument per a trencar el pellet i llavar-ho. Açò elimina algunes de les sals presents en el sobrenadante sobrer i unides al pellet de ADN fent que el ADN final estiga més net. Esta suspensió es centrifuga de nou per a tornar a tindre pellet de ADN i s'elimina la solució sobrenadante. Este pas es repetix una volta.

Finalment, el pellet se seca a l'aire i el ADN es resuspende en aigua o un atre tampó desijat. És important no secar massa el pellet, ya que pot provocar la desnaturalización de el ADN i dificultar el seu resuspensión.

També es pot utilisar isopropanol en lloc d'etanol; l'eficàcia de precipitació del isopropanol és major, per lo que un volum és suficient per a la precipitació. No obstant, el isopropanol és menys volàtil que l'etanol i necessita més temps per a secar-se a l'aire en l'últim pas. El pellet també pot adherir-se menys al tubo quan s'utilisa el isopropanol.